EXTRAÇÃO, IDENTIFICAÇÃO E ESTUDO DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO DO ÓLEO ESSENCIAL DE PIMENTA-PRETA (Piper nigrum L.), BIOMONITORADO POR Artemia salina Leach

Abstract

The objective was to extract and identify the chemical constituents of the essential oil of black pepper (Piper nigrum L.), study its antimicrobial potential and biomonitored the oil through the cytotoxic potential test. The plant material showed a yield of 1.15% of essential oil, where 38 compounds were identified by chromatography, the major constituents being: sabinene (30.62%), limonene (21.43%), karyophylene (21%), ß - pinene (9.62%) and a -pinene (5.31%). Listeria monocytogenes and Clostridium perfringens presented lower MIC, with 30.92 ^g/mL. [...]black pepper essential oil is a promising antimicrobial, being a possibility of future application, as a natural preservative in the food industry. Natural products, bioactive compounds, gas chromatography, microorganisms, toxicity 1 INTRODUÇAO A crescente busca por alimentos saudáveis induzem as industrias a comercializarem produtos com teores reduzidos de gordura, aditivos e conservantes químicos, priorizando a qualidade do produto final.

Headnote

Submetido 04/07/2020 - Aceito 18/12/2020

DOI: 10.15628/holos.2021.10663

RESUMO

Os óleos essenciais sao eficazes agentes antimicrobianos devido aos compostos bioativos que possuem. Objetivouse extrair e identificar os constituintes químicos do óleo essencial da pimenta-preta (Piper nigrum L.), estudar o seu potencial antimicrobiano e biomonitorar o óleo através do teste de potencial citotóxico. Extraiu-se o óleo essencial pelo método de destilaçao por arraste a vapor. O óleo foi analisado quanto a sua composiçao química e submetido ao biomonitoramento por Artemia Salina Leach e posterior teste de atividade antimicrobiana e de concentraçao inibitória mínima (CIM). O material vegetal apresentou rendimento de 1,15% de óleo essencial, onde 38 compostos foram identificados por cromatografía, sendo os constituintes majoritários: sabinene (30,62%), limoneno (21,43%), cariofileno (21%), ß - pineno (9,62%) e a -pineno (5,31%). O óleo essencial apresentou CL50 8,48 ^g/mL frente a Artemia salina Leach. As bactérias Listeria innocua (15,60 mm) e Escherichia coli (5,60 mm), apresentaram menor e maior resistencia ao óleo essencial estudado, respectivamente. Listeria monocytogenes e Clostridium perfringens apresentaram menor CIM, com 30.92 ^g/mL. Desta forma, o óleo essencial de pimenta preta mostra-se um antimicrobiano promissor, sendo uma possibilidade de aplicaçao futura, como um conservante natural na industria de alimentos.

PALAVRAS-CHAVE: Produtos naturais, compostos bioativos, cromatografia gasosa, micro-organismos, toxicidade.

ABSTRACT

The essential oils are effective antimicrobial agents due to the bioactive compounds they have. The objective was to extract and identify the chemical constituents of the essential oil of black pepper (Piper nigrum L.), study its antimicrobial potential and biomonitored the oil through the cytotoxic potential test. The essential oil was extracted by steam distillation. The oil was analyzed for its chemical composition and subjected to biomonitoring by Artemia Salina Leach and subsequent antimicrobial activity and minimal inhibitory concentration (MIC). The plant material showed a yield of 1.15% of essential oil, where 38 compounds were identified by chromatography, the major constituents being: sabinene (30.62%), limonene (21.43%), karyophylene (21%), ß - pinene (9.62%) and a -pinene (5.31%). The essential oil showed CL50 8.48 ^g/mL compared to Artemia salina Leach. The bacteria Listeria innocua (15.60 mm) and Escherichia coli (5.60 mm), presented lower to greater resistance to the essential oil studied, respectively. Listeria monocytogenes and Clostridium perfringens presented lower MIC, with 30.92 ^g/mL. Thus, black pepper essential oil is a promising antimicrobial, being a possibility of future application, as a natural preservative in the food industry.

KEYWORDS: Natural products, bioactive compounds, gas chromatography, microorganisms, toxicity

1 INTRODUÇAO

A crescente busca por alimentos saudáveis induzem as industrias a comercializarem produtos com teores reduzidos de gordura, aditivos e conservantes químicos, priorizando a qualidade do produto final. Com isso, pesquisas relacionadas a produtos naturais ricos em compostos bioativos e que apresentem características antimicrobianas estao cada vez mais frequente, se tornando uma tendencia e alternativa para a conservaçao de alimentos.

De acordo com Dong et al. (2014), as bacterias estao sofrendo processos de mutaçöes e alguns dos antimicrobianos utilizados anteriormente, objetivando inibiçao, já nao apresentam atividade. Por isso, tem-se a necessidade de aprofundar estudos acerca deste assunto. O uso de produtos naturais e seus derivados nas industrias de alimentos, farmacéutica, cosmética e química tem aumentado, devido a fatores como a proliferaçao microbiana e sua multirresisténcia aos antibióticos e aos agentes químicos sintéticos (Silva et al. 2015).

Um produto alternativo com potencial aplicaçao na industria de alimentos sao os óleos essenciais, ricos em compostos bioativos voláteis e complexos, caracterizados por um forte odor, sendo sintetizados por plantas durante o metabolismo secundário e normalmente extraído de vegetais encontrados em países quentes (Machado; Fernandes Júnior, 2011; Yazgan, 2020). Uma das vantagens da utilizaçao dos óleos essenciais é que grande parte dos compostos ativos da planta estao presentes em maior quantidade no óleo (Oetting, 2005), fazendo com que os benefícios causados pelo material, quando adicionado ao alimento, sejam mais eficazes comparando a outras partes da planta.

As especiarías sao conhecidas por exercerem estabilidade frente a açao de microorganismos, estando inseridas no grupo dos alimentos estáveis (Lima, 2002). A literatura científica na área da ciencia e tecnologia de alimentos tem mostrado, nos últimos anos, um enfoque no estudo do potencial antimicrobiano das especiarias, considerando a sua inclusao nos chamados sistemas de bioconservaçao de alimentos (Melo et al. 2020).

Dentre as especiarias comumente utilizadas em alimentos está a pimenta-preta (Piper nigrum L.). O óleo essencial de pimenta-preta, também conhecido como pimenta-do-reino, tem uso diverso entre as industrias. Ristori, Pereira e Gelli (2002) afirmaram que um dos componentes que contribuem para aumentar o valor da pimenta-preta no mercado como condimento é o seu óleo essencial, devido a açao inibitória desta especiaria em diferentes micro-organismos. Desta forma, o uso deste óleo na industria de alimentos é uma alternativa viável como conservante natural em alimentos.

Diante disto, observa-se que a utilizaçao do óleo essencial de pimenta-preta além de agregar valor aos produtos, serve como agente ativo para prolongar a vida util de alimentos, mantendo suas características. Por isso, objetivou-se neste trabalho extrair e identificar os constituintes químicos do óleo essencial da pimenta-preta (Piper nigrum L.), estudar o seu potencial antimicrobiano e avaliar o potencial citotóxico em Artemia salina Leach, a fim de compreender a atividade deste material vegetal.

2 REVISÂO BIBLIOGRÁFICA

2.1Pimenta-preta

A pimenta-preta, conhecida botánicamente como Piper nigrum L., é uma planta perene da família das piperáceas (Silva; Silva; Joele, 2009) e, segundo Mobot (2005), é uma planta com caule liso, redondo, nodoso e ramificado, com folhas inteiras, lâminas ovaladas, ápice agudo, coriáceas e com sete nervuras principais. Já as flores sao pequenas, brancas, dispostas em espigas e com os frutos globulares, vermelhos quando maduros, que ao secarem possuem uma superficie grossa e rugosa.

Entre as espécies mundialmente conhecidas e consumidas de pimenta, tem-se a pimentapreta, conhecida popularmente no Brasil como pimenta-do-reino (Calixto et al., 2005; Pissinate, 2006). A pimenta-preta é originária da India e, desde a década de 1930, quando foi introduzida no Brasil, por imigrantes japoneses, tem sido o suporte económico de pequenos e grandes produtores da Regiao Amazónica (Chu, 2006). O Brasil é um dos maiores produtores desta especiaría e o segundo maior exportador mundial dessa commodity, tendo os estados do Pará, Espirito Santo, Bahia, Paraíba e Maranhao como os maiores produtores nacionais (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística [IBGE], 2013; Alves et al., 2014).

A comercializaçao nacional da pimenta-preta é vista comumente em graos secos (Figura 1), obtida por secagem natural ou artificial, ou moída, principalmente para uso culinário, sendo considerada como a única especiaria cujos frutos podem ser comercializados em quatro diferentes versóes: branca, verde, vermelha e preta (Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento - [MAPA], 2006; Carnevallia e Araújo, 2013).

Sabe-se que esta é uma planta rica em retinol (pró-vitamina A), ácido ascórbico (vitamina C), e em minerais como ferro e potássio entre outros compostos, por isso seu forte uso culinário. Porém, nas últimas décadas, seu consumo além do grao seco ou moído, diversificou-se através da obtençao do óleo essencial, resina e oleorresina, devido a quantidade de compostos isolados encontrados na especie (Silva; Silva; Joele, 2009; Carnevallia; Araújo, 2013), tornando os compostos da pimenta-preta alvo de estudos para avaliar sua atividade.

2.2Óleo essencial

Koketsu e Gonçalves (1991) citam que os óleos essenciais, em sua maioria, sao produtos obtidos por processo de destilaçao por arraste com vapor de água ou hidrodestilaçao, podendo também ser extraído por outras metodologias. Estes podem se apresentar isoladamente ou misturados entre si, retificados, desterpenados ou concentrados (Zacarao; Piletti, 2013). De acordo com Koketsu e Gonçalves (1991), óleo essencial é uma designaçao que se aplica a óleos etéreos ou voláteis constituidos de misturas complexas de substancias de variada funçao química, presentes em diversas partes dos vegetais como: flores, folhas, frutos, lenho e sementes.

Os óleos essenciais sao conhecidos pela fragrancia e propriedades fortes pela sua atividade antisséptica, ou seja, bactericida, fungicida, antivirais e medicinais e podem ser utilizados como antimicrobianos na conservaçao de alimentos, além de analgésicos, sedativos e anti-inflamatórios (Aquino et al., 2010). Por isso os óleos essenciais tornaram-se fonte de pesquisa, objetivando explorar a atividade realizadas pelos compostos presentes nos vegetais, tornando-se uma alternativa natural, principalmente para conservaçao de alimentos, tendo em vista a atual procura por uma alimentaçao saudável e mais próxima do natural.

A parte do vegetal em que o óleo essencial é encontrado depende da espécie, embora todos os órgaos de uma planta possam acumular óleos essenciais, sua composiçao pode variar segundo sua localizaçao na estrutura do vegetal, assim como composiçao química, a qualidade e o teor de óleos essenciais presentes nas plantas estao sujeitos a grande variaçao e sao influenciados por diversos fatores, tais como: condiçöes geográficas e climáticas, assim como condiçöes de cultivo, secagem e armazenamento (Melo et al., 2004; Simôes et al., 1999).

Os óleos essenciais sao geralmente extraídos das plantas por métodos de destilaçao, que pode ser simples ou por arraste a vapor, dióxido de carbono (CO2) supercrítico, hidrodestilaçao e extraçao por solvente (Simôes & Spitzer, 1999). Leal (2008) cita a popularidade da técnica de destilaçao por erraste a vapor (AV) afirmando que é o processo de obtençao de óleos voláteis mais tradicionalmente utilizado no Brasil e no mundo, mostrando que é uma metodologia considerada limpa e que nao agride o meio ambiente.

2.3Atividade antimicrobiana dos óleos essenciais

Antimicrobianos de origem natural, provenientes de vegetais, sao alternativas eficazes e na maioria das vezes económicas, pois sao obtidos a partir das plantas aromáticas e especiarías ricas em óleos essenciais caracterizados por uma notável atividade antimicrobiana, tornando-se viável no retardamento ou inibiçao do crescimento de micro-organismos e pragas.

O estudo de óleos essenciais para conservaçao e atividade antimicrobiana está cada dia mais frequente. Os componentes dos óleos essenciais exercem atividade antimicrobiana básicamente por trés motivos: interferencia na dupla camada fosfolipídica da parede celular por aumento da permeabilidade e perda dos constituintes celulares; alteraçao de uma variedade de sistemas enzimáticos, incluindo aqueles envolvidos na produçao de energia celular e síntese de componentes estruturais e inativaçao ou destruiçao do material genético (Kim, 1995; Ristori; Pereira; Gelli 2002)

A atividade dos óleos essenciais e de seus constituintes majoritários podem variar quando avaliados separadamente. Em seu estudo com o óleo essencial de Thymus pectinatus , VandarUnlu et al. (2003), encontraram uma composiçao majoritária de timol, y-terpineno, p-cimeno e carvacrol, verificando uma boa atividade antimicrobiana, porém, quando comparados separadamente, esses compostos apresentaram baixa atividade, mostrando que a atividade está relacionada com o conjunto de substancias.

Em um estudo realizado por Romero et al. (2012) com o óleo essencial de óregano (Origanum vulgare) sobre fungos fitopatogénicos testado em quatro concentraçöes, observou-se que todos os fungos testados apresentaram inibiçao do crescimento micelial e da germinaçao de esporos pela açao do óleo essencial, para concentraçöes a partir de 500 ppm. Na concentraçao de 250 ppm (menor concentraçao), observou-se que o óleo essencial de orégano inibiu o crescimento micelial dos fungos Corynespora cassiicola, Fusarium sp. e Colletotrichum gloeosporioides, em 64,81, 73,95 e 33,58%, respectivamente, nao afetando o crescimento micelial e a germinaçao de esporos do fungo Rhizoctonia solani.

Brahmi et al., (2016) verificaram a atividade antimicrobiana do óleo essencial de Mentha pulegium L. em cinco micro-organismos: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae, pelo método de disco-difusao, e verificaram que o óleo testato apresentou boa boa atividade de inibiçao de crescimento microbiano. Santos e Rabelo (2012) pesquisaram atividade antifúngica e antibacteriana do óleo essencial das folhas de Piper malacophyllum. Para todas as bactérias analisadas (Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Acinetobacter baumanii, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa), o óleo essencial apresentou atividade classificada como fraca. Todavia, o óleo essencial apresentou ótima atividade contra seis dos dez fungos analisados.

Outro estudo realizado por Pereira (2006) avaliou o efeito do óleo essencial de duas especiarías: orégano (Origanum vulgare) e cravo-da-índia (Syzygium aromaticum), nas bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli e também o fungo Penicillium communem, verificando bons resultados quanto as bactérias testadas, mostrando a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais testados. Há uma diversidade de estudos relacionados aos óleos essenciais, a fim descobrir os efeitos de seus variados compostos no comportamento dos micro-organismos. Entretanto, todos os estudos apontam que os óleos essenciais sao um ingrediente de potencial aplicaçao na indústria de alimentos.

3.MATERIAL E MÉTODOS

3.1.Extraçao do óleo essencial

As sementes de pimenta-preta foram compradas no municipio de Joao Pessoa - PB, Brasil (07° 06 '55 "S, 34° 51' 40" W). O óleo essencial da pimenta-preta foi extraído através do método de destilaçao por arraste a vapor, com o destilador de óleo essencial em aço inox do modelo SL76/I da marca SOLAB e potencia de 1.800 Watts. O processo de destilaçao foi realizado por 3h e a temperatura foi controlada a 100 °C. Após o processo de destilaçao, foi retirado o excesso de água do óleo essencial com o sulfato de sódio anidro (Na2SO4). O rendimento de extraçao foi calculado a partir da razao de massa de óleo, medida por sua densidade com base no volume (mL) de óleo extraído no sistema de extraçao e dividido pela massa seca (g) da amostra (Girard, 2007). O óleo foi armazenado em recipiente de vidro âmbar e mantido sob refrigeraçao a 4 °C.

3.2. Cromatografía Gasosa

A composiçao química do óleo essencial de pimenta-preta foi analisada por meio do Cromatógrafo Gasoso acoplado a Espectrómetro de Massas do modelo GCMS-QP2010 da marca Shimadzyu. A coluna utilizada foi da marca RTX-5MS, capilar (5% Diphenyl / 95% dimethyl polysiloxane), Tamanho: 30 mm de comprimento e 0,25 mm de Diámetro Interno, 0,25 um (df - diámetro do filtro da coluna), temperatura do forno da coluna de 60 °C, temperatura de injeçao de 250 °C, pressao de 57 kPa, fluxo da coluna de 0,99 mL/min. O espectrómetro de massa foi programado para varrer de 40,0 a 450,0 m / z.

3.3. Atividade citotóxica

A toxicidade do óleo essencial de pimenta-preta foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Meyer et al., (1982). O bioensaio consistiu em inserir os ovos de Artemia salina em uma soluçao preparada com o óleo essencial solubilizado em água salina e Tween 80, sob aeraçao constante por um periodo de 48 horas, a temperatura controlada (25 °C). As concentraçöes variaram entre 0 e 1000ppm. Após 24 h de exposiçao, quantificaram-se as contagens de microcrustáceos vivos e mortos.

3.4.Atividade antimicrobiana

3.4.1.Cepas bacterianas

Para realizaçao da atividade antimicrobiana do óleo essencial de pimenta utilizou-se tres culturas de bactérias patogenicas Gram positivas e duas culturas de bactérias Gram negativas. As Gram positivas utilizadas foram: Listeria innocua (ATCC 33090), Listeria monocytogenes (ATCC 1911) e Clostridium perfringens (ATCC 3624); as bactérias Gram negativas foram Campylobacter jejuni subsp. Jejuni (ATCC 33560) e Escherichia coli (ATCC 10536). Todos os micro-organismos foram adquiridos no Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde, ligado a fundaçao Oswaldo Cruz/Ministério da Saúde, Rio de Janeiro - RJ, Brasil.

3.4.2.Disco-difusao

Para a avaliaçao da atividade antimicrobiana seguiu-se a metodologia de disco-difusao em Ágar conforme descrito na norma M2-A8 do Clinical and Laboratory Standards Institute - CLSI/NCCLS (NCCLS, 2005), que trata dos testes de sensibilidade a antimicrobianos. Os testes foram realizados pelo método de difusao em discos de papel Whatmann 3 com 6 mm de diámetro, feitos com um perfurador estéril, e adicionados em placas de Petri com meio de cultura Ágar MüellerHinton. Os discos foram embebidos em 10 pL contendo óleo essencial a 1% e distribuido uniformemente nas placas contendo as bactérias. Estas placas foram incubadas a 37 ± 2 °C por 24 horas. A atividade antimicrobiana foi analisada medindo-se o diámetro das zonas de inibiçao (mm) ao redor do halo usando um paquimetro.

3.4.3.Concentraçao Inibitória Mínima (CIM)

A determinaçao da Concentraçao Inibitória Mínima foi realizada através da micro diluiçao em caldo BHI (Brain Heart Infusion), seguindo a Norma M2-A8 do Clinical and Laboratory Standards Instituite - CLSI/NCCLS (NCCLS, 2005), com incubaçao das bactérias em placas de Petri e posterior adiçao dos discos contendo óleo essencial de pimenta-preta para verificaçao dos halos. Para verificaçao da CIM, após incubaçao a 35 °C por 24 horas das placas de Petri, contendo os discos embebidos, a menor concentraçao de óleo na qual nao foi evidenciado crescimento microbiano nos discos foi determinada como CIM, conforme descreve Machado et al., (2012).

3.5.Análise estatistica

Para avaliaçao citotóxica do óleo, o resultado foi expresso pela dose letal a 50% (CL50) com limite de confiança de 95%, calculado através do método estatistico de Próbit, utilizando o programa Polo-plus 1.0 (2002). Os dados da atividade antimicrobiana foram submetidos a análise de variáncia e ao teste de Tukey ao nivel de 5% de probabilidade, utilizando-se o programa estatistico SAS® versao 9.1 (2013).

4.RESULTADOS E DISCUSSÄO

4.1. Rendimento de extraçao

O óleo essencial de pimenta-preta obtido na extraçao apresentou coloraçao amarelada. A amostra apresentou densidade de 0,8262 g/mL a 25 °C, valor inferior ao obtido por Melo et al. (1990) que estudaram alternativas de aproveitamento industrial de pimenta-preta e obtiveram densidade de 0,8772 g/mL.

O óleo essencial de pimenta-preta apresentou rendimento de 1,15%. Este valor foi inferior a Costa et al., (2010), que em seu estudo com óleo essencial de pimenta-preta obtiveram rendimento de 1,8%, valor superior ao presente estudo, e corroborou com o trabalho de Melo et. al. (1990) que também obtiveram 1,8% para o óleo desse vegetal, quando a amostra foi seca em secador solar. Segundo Luiz et al., (2009), o conteúdo presente nos óleos essenciais e seu rendimento podem variar de acordo com a espécie, parámetros climáticos e de fatores agronómicos e, especialmente a fase de desenvolvimento da planta na época da colheita, além de outros fatores. Este fato mostra que o rendimento atingido neste estudo é decorrente do manejo e condiçöes externas sofridas pelas sementes, acarretando menor teor de óleo essencial.

4.2. Composiçao química

Os resultados da análise cromatográfica do óleo essencial de pimenta-preta (Tabela 1) elucidou 96,74% dos constituintes químicos em diferentes proporçöes, totalizando em 38 compostos, possuindo como componentes majoritários quatro monoterpenos: sabineno (30,62%), limoneno (21,43%), ß-pineno (9,62%), a-pineno (5,31%) e careno (2,37%). Além dos monoterpenos, dentre os compostos de maior concentraçao no óleo encontrou-se o sesquiterpeno cariofileno (21,00%).

A composiçâo química média do óleo essencial da pimenta-preta possui cerca de 80% de monoterpenos como hidrocarbonetos monoterpenicos (sabineno, ß-pineno, limoneno, terpineno, a-pineno, mirceno), monoterpenos oxigenados (borneol, carvona, carvacrol, 1,8-cineol e linalol) 20% de compostos sesquiterpenicos (ß-cariofileno, humuleno, ß-bisabolona e óxido carofileno) e com quantidades vestigiárias de eugenol, miristicina e safrol (Cunha et al., 2012). Orav et al., (2004) e Liu et al., (2007) afirmaram que os constituintes de maior proporçao sao: ß-cariofileno, dlimoneno e ß-pineno, evidenciando que o óleo essencial extraído apresenta um perfil cromatográfico com substâncias majoritárias semelhantes as desenvolvidas em outros estudos. Costa et al. (2010) avaliando a composiçâo química de diferentes espécies de Piper evidenciaram 97,3% dos componentes totais para o óleo de Piper nigrum, referente a 17 substâncias. Os constituintes majoritários encontrados por Costa e seus colaboradores (2010) foram similares aos encontrados na cromatografía realizada neste estudo: E-Cariofileno (24,2%), (20,01%), Sabineno (19,9%), Limoneno (13%) e Pineno (5,4%). Sendo esses compostos considerados antimicrobianos.

Souza Filho et al. (2009) confirmam que existe considerável variaçao na composiçâo dos constituintes do óleo essencial de certas espécies de plantas e que esta variaçao pode ser funçao da sazonalidade, das condiçöes edafoclimáticas, da diferença entre individuos de diferentes populaçöes ou mesmo de uma mesma populaçao. Além dos fatores intrínsecos da planta, a metodologia de extraçao do óleo, tempo de extraçao, manuseio de armazenamento do óleo, exposiçao do óleo durante extraçao. Além de também apresentarem diferenças nas proporçöes dos componentes, pois os compostos ativos dos óleos essenciais sao altamente voláteis (Machado; Fernandes Junior, 2001). Com isso, sao facilmente perdidos até mesmo durante a extraçao.

4.3.Atividade citotóxica

No ensaio de toxicidade de Artemia Salina Leach os índices de mortalidade variaram entre 0 e 100% nas proporçöes utilizadas. A concentraçao letal de óleo essencial de pimenta-preta necessária para matar 50% dos microcrustáceos (CL50) foi calculada em 8,49 pg/mL (Tabela 2), variando de 7,87 a 21,53 pg/mL entre as CL50 e CL90. . O teste de toxicidade por Artemia salina é um teste biológico considerado uma das ferramentas utilizadas na avaliaçao preliminar de toxicidade (Luna, 2005). Meyer et al.,(1982) menciona que teste com Artemia salina pode ser utilizado por farmacologistas e químicos de produtos naturais. Os autores explicam que para a concentraçao letal ser considerada tóxica o óleo deve conter CL50 ^ 30 ppm. Assim, nota-se na Tabela 3 que o óleo essencial de pimenta-preta apresentou atividade tóxica para o teste em Artemia Salina. Isto indica que este óleo essencial possui beneficio ao consumidor, quando aplicado em dosagens adequadas, por se tratar de um teste preliminar com atividade anticáncer, inseticida, moluscicida e antifúngico (McLaughlin, Chang & Smith 1991; Assis et al., 2019)

4.4.Atividade antimicrobiana e Concentraçao Inibitória Mínima

As zonas de inibiçao de crescimento das bactérias variaram significativamente (p<0,05) com o teste de disco-difusao do o óleo esssencial de pimenta-preta (Tabela 3). Listeria innocua mostrou-se menos resistente a açao do óleo essencial, apresentando a maior zona de inibiçao, com 15,60 mm e menor concentraçao inibitória mínima (CIM). O micro-organismo em que o óleo essencial foi menos efetivo para o ensaio antimicrobiano foi Escherichia coli, com zona de 5,60 mm e maior CIM.

As zonas de crescimento avaliadas variaram entre 5,60 e 15,60 mm, esses valores variam entre as bactérias Gram-negativas e Gram-positivas e com o comportamento do micro-organismo com os compostos presentes no óleo. Zacarao e Piletti (2013) afirmam que as bactérias Gramnegativas apresentam maior resistencia a açao de agentes antimicrobianos por terem uma superficie hidrofílica na membrana externa, rica em lipopolissacarídeos, formando uma barreira contra as macromoléculas hidrofóbicas presentes em alguns óleos essenciais e antibióticos. Por isso a Escherichia coli e a Campylobacter jejuni subsp. Jejuni mostraram maior resistencia ao óleo essencial de pimenta-preta, enquanto Listeria innocua e Listeria monocytogenes foram menos resistentes e obtiveram maiores zonas e inibiçao.

Zacarao e Piletti (2013) observaram em seu estudo com óleo essencial de pimenta-preta para controle de crescimento microbiano que a bactéria S. aureus, reduziu o crescimento em aproximadamente 95% para a concentraçao de 0,02 mL/mL e ressalta, que para as menores concentraçöes também se observou reduçao no crescimento de Escherichia coli em aproximadamente 30%, mostrando que o óleo tem grande potencial de aplicaçao para este microorganismo.

Ristori, Pereira e Gelli (2002) mostram em seus resultados, também com reduçao do crescimento microbiano, que nao foi apresentada diferença significativa entre os seus meios controles e os meios testes, mostrando assim que a pimenta-preta moida e o seu óleo essencial nao foram eficientes para inibir o desenvolvimento de Salmonella rubislaw. Eles afirmam que a inibiçao pode ocorrer em diferentes micro-organismos e que o óleo essencial pode nao se solubilizar de forma adequada, interferindo na inibiçao, assim como a variaçao na composiçao do óleo em funçao das condiçöes de cultivo também alteram a composiçao do óleo. Confirmando o estudo de Ristori, Pereira e Gelli (2002), Stoyanova et al. (2006) demonstraram uma atividade antimicrobiana significante dos óleos essenciais de pimenta-preta contra bactérias Gram positivas. Verifica-se que o óleo essencial de pimenta-preta mostrou-se eficaz com o estudo antimicrobiano, sendo um material rico em compostos bioativos que possam proporcionar novos estudos e aplicaçöes na área de alimentos.

5.CONCLUSÄO

O óleo essencial de pimenta-preta mostrou-se um material com rendimento satisfatório para este tipo de produto e que apresentou característica antimicrobiana para micro-organismos patogénicos que sao capazes de se desenvolver em alimentos. Com isso, o óleo essencial em estudo mostra-se um antimicrobiano promissor de potencial fonte de aplicaçao, como um conservante natural na industria de alimentos.

Sidebar

COMO CITAR ESTE ARTIGO:

Melo, A. M. de, Silva, E. O., Marques, D. I. D., Quirino, M. R., Sousa, S. de (2020). Extraçao, identificaçao e estudo do potencial antimicrobiano do óleo essencial de pimenta-preta (Piper nigrum L.), biomonitorado por Artemia salina Leach. Holos. 37(1), 1-16.

SOBRE OS AUTORES

A. M. DE MELO

Doutoranda no Programa de Pós-graduaçäo em Engenharia de Alimentos da Universidade Federal do Paraná. E-mail: [email protected]

ORCID ID: https://orcid.org/0000-0001-7795-6682

E. O. SILVA

Mestranda do Programa de Pós Graduaçao em Tecnología Agroalimentar do Centro de Ciencias Humanas, Sočiais e Agrárias (CCHSA) da Universidade Federal da Paraíba. E-mail: [email protected]

ORCID ID: https://orcid.org/0000-0002-6068-9255

D. I. D. MARQUES

Técnico do Laboratório da Química do Centro de Ciencias Humanas, Sociais e Agrárias (CCHSA) da Universidade Federal da Paraíba. E-mail: diego [email protected]

ORCID ID: https://orcid.org/0000-0002-6477-1643

M. R. QUIRINO

Professor do Departamento de Ciencias Básicas e Sociais do Centro de Ciencias Humanas, Sociais e Agrárias (CCHSA) da Universidade Federal da Paraíba. E-mail: [email protected]

ORCID ID: https://orcid.org/0000-0003-2873-261X

S. DE SOUSA

Professora do Departamento de Gestao e Tecnologia Agroindustrial do Centro de Ciencias Humanas, Sociais e Agrárias (CCHSA) da Universidade Federal da Paraíba. E-mail: solange [email protected]

ORCID ID: https://orcid.org/0000-0002-8587-4828

Editor(a) Responsável: Francinaide de Lima Silva Nascimento

Pareceristas Ad Hoc: ARIVONALDO DA SILVA E SOFIA SUELY BRANDÄO

References

6.REFERENCIAS

Alves, D. A.; Perazzini, H.; Freire, F. B.; Freire, J. T. Análise da utilizaçao de modelos difusivos na secagem de pimenta-do-reino preta (Piper nigrum L.). In: XX CONGRESSO BRASILEIRO DE ENGENHARIA QUIMICA (COBEQ), Área temática: Fenómenos de Transporte e Sistemas Particulados. 2014.

Aquino, L.C.L.; Santos, G.G.; Trindade, R.C.; Alves, J.A.B.; Santos, P.O.; Carvalho, L.M.; Alves, P.B.; BLANK, A.F. (2010). Atividade antimicrobiana dos óleos essenciais de erva-cideira e manjericao frente a bacterias de carnes bovinas. Revista Alimentaçao e Nutriçao. 21(4), 529-535.

Assis, R, Q; K.L. Andrade, L.E. Gomes Batista, A. de Oliveira Rios, D.R. Dias, E.A. Ndiaye, É.C. de Souza. (2019) Characterization of mutamba (Guazuma ulmifolia LAM.) fruit flour and development of bread, Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. 19, 101-120. https://doi.org/10.10167j.bcab.2019.101120

Brahmi, F.; Abdenourb A.; Brunoc, M.; Silviac, P,; Alessandrac, P.; Daniloc, F.; Drifaa, Y. G.; Fahmie, E. M.; Khodira, M.; Mohamed, C. (2016). Chemical composition and in vitro antimicrobial, insecticidal and antioxidante activities of the essential oils of Mentha pulegium L. and Mentha rotundifolia (L.) Huds growing in Algeria. Ind. Crops Prod. v. 88, p. 96 - 105.

Calixto, J.B. et al. (2005). Contribution of natural products to the discovery of the transient receptor potential (TRP) channels family and their functions. Pharmacol Ther., v.106, n.1, p.109- 178.

Carnevallia, D. B.; Araujo, A. P. S. (2013). Atividade Biológica da Pimenta Preta (Piper nigrun L.): Revisao de Literatura. UNICIENCIAS, v. 17, n. 1, p. 41-46, Dez. 2013.

Chu, E.Y., et al. A cultura da pimenta do reino. Brasilia: Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária -EMBRAPA: 2.ed., 2006.

Costa J.G.M., Santos P.F., Brito S.A., Rodrigues F.G.G., Coutinho H.D.M., Botelho M.A. & Lima S.G. (2010). Composiçao Química e Toxicidade de Óleos Essenciais de Especies de Piper Frente a Larvas de Aedes aegypti L. Latin American Journal of Pharmacy. v. 29. n. 3, p. 463-467.

Cunha, A. P. M. A.; Roque, O. L. R.; Nogueira, M. T.; Plantas aromáticas e óleos essenciais composiçao e aplicaçao. Coimbra: fundaçao calouste gulbenkian, 2012. 545 p.

Dong, H.; Xiang, Q.; Gu, Y.; Wang, Z.; Paterson, N. G.; STansfeld, P. J.; He, C.; Zhang, Y.;Wnag, W.; Dong, C. Structural basis for outer membrane lipopolysaccharide insertion. NATURE International weekly jornal of Science. V. 511, p. 52-56, 2014.

Girard, E. A.; Koehler, H. S.; Péllico Netto, S. (2007). Volume, biomassa e rendimento de óleos essenciais do craveiro (Pimenta pseudocaryophyllus (Gomes) LANDRUM). Rev. Acad., Curitiba, v. 5, n. 2, p. 147-165.

Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística - IBGE. Levantamento Sistemático da Produçao Agrícola:Pesquisa Mensal de Previsao e Acompanhamento das Safras Agrícolas no Ano Civil.Rio de Janeiro: IBGE, v.26 n.1 p.1-83. Janeiro. 2013.

Kim, J.M.; Marshall, M. R.; Cornell, J.A; Preston, J.F.; Wei, C. I. (1995) Antibacterial Activity of carvacrol, citral and geraniol against Salmonella typhimurium in Culture Medium and on Fish Cubes. Journal of Food Science, v.60, n.6, p.1364-68.

Koketsu, M. Gonçalves, S. L. Óleos essenciais e sua extraçao por arraste a vapor. Rio de Janeiro, EMBRAPA-CTAA. 1991, 24p

Leal, P.F. Estudo comparativo entre os custos de manufatura e as propriedades funcionais de óleos voláteis obtidos por extraçao supercrítica e destilaçao por arraste a vapor. Tese de Doutorado em Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, 2008.

Lima, E. O. (2002). Plantas e suas propriedades antimicrobianas: uma breve análise histórica. In: YUNES, R. A.; Calixto, J. B. Plantas medicinais sob a ótica da química medicinal moderna. Chapecó: Agros, p. 482-501.

Luiz, J.M.Q.; Morais, T.P.S.; Blank, A.F.; Sodré, A.C.B.; Oliveira, G.S. (2009). Teor, rendimento e composiçao química do óleo essencial de manjericao sob doses de cama de frango. Horticultura Brasileira, v. 27, n.3, jul/set:349-353.

Luna, D. D.; , A.F. Santos, M.R.F. De Lima, M.C. De Omena, L.W. Bieber, A.E.G.S. Ana, A study of the larvicidal and molluscicidal activities of some medicinal plants from northeast Brazil, 97 (2005) 199-206. https://doi.org/10.1016/j.jep.2004.10.004.

Machado, B. F. M. T.; Fernandez Júnior, A. Óleos essenciais: aspectos gerais e usos em terapias naturais. Cadernos académicos. Tubarao, vol. 3, n. 2, pp. 105-127, 2011.

McLaughlin, J.L.; Chang, C.J.; Smith, D.L. (1991). "Bench - top" bioassay s for the discovery of bioactive natural products: an update, p. 383-409. In: Rahman, A. (Org.). Studies in Natural Product Chemistry, 9th ed., Elsevier, Amsterdam.

Melo, E.C.; Radünz, L. L.; Melo, R. C. A. (2004). Influéncia do processo de secagem na qualidade de plantas medicinais: revisao. Engenharia na Agricultura, Viçosa, MG, v.12, n.4, 307-315.

Melo, A. M. De, Cristina, R., Barbi, T., Felipe, W., Souza, D., Costa, L., ... Solange, Q. (2020). Microencapsulated lemongrass ( Cymbopogon flexuosus ) essential oil : A new source of natural additive applied to Coalho cheese. Journal of Food Processing and Preservetion, (January), 1-12. https://doi.org/10.1111/jfpp.14783

Meyer, B. N,N. R. Ferrigni; J. E. Putnam; L. B. Jaconsen; D. E. Nicholas; J. L. Mclau, meyer. (1982), A convenient general bioassays for active plant tituents. Journal of Medicinal Planyt Research. 45, 31-34.

Ministerio da agricultura e do abastecimento - MAPA.Instruçao normativa n° 10 de 15 de maio de 2006. Regulamento Técnico Geral para fixaçao dos Padrôes de Identidade e Qualidade de Pimenta-do-reino.

Mobot. (2005). Manual de plantas. Disponível em: <http://www.mobot.org/manual.plantas/lista.html >. Acesso em: 05 de setembro, 2019.

NCCLS, Metodologia dos Testes de Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos por Diluiçao para Bacteria de Crescimento Aeróbico, 2005.

Oetting, L.L. Extratos vegetais como promotores do crescimento crescimentos de leitôes recémdesmamados. Tese de doutorado em Agronomia. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, p.22, 2005.

Orav, A.; Stulova, I.; Kailas, T.; Müürisepp, M. (2004). Effect of storage on the Essential Oil Composition ok Piper nigrum L. fruites of different ripening states. Journal of Agricultural Food Chemistry. Vol 52. n 2582.

Pissinate, K. (2006) Atividade citotóxica de Piper nigrum e Struthanthus marginatus. Estudo preliminar da correlaçao entre a citotoxicidade e hidrofobicidade da piperina e derivados sintéticos. Rio de Janeiro: Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro.

Pereira, A. A. (2006). Efeito inibitório de óleos essencial sobre o crescimento de bacteria e fungos. Lavras. Dissertaçao, Departamento de Ciencia dos Alimentos, Universidade Federal de Lavras, 58p.

Ristori, C. A., Pereira, M. A. S; Gelli,D. S. (2002). O efeito da pimenta do reino preta moída frente a contaminaçao in vitro com Salmonella Rubislaw. Rev. Inst. Adolfo Lutz, v. 62, n. 2, p. 131-133.

Romero A. L.; Romero, R. B; Silva, E. L.; Diniz, S. P. S. S.; Oliveira, R. R.; Vida, J. B. (2012). Composiçao Química e Atividade do Óleo Essencial de Origanum vulgare Sobre Fungos Fitopatogenicos. UNOPAR Científica Ciencias Biológicas e da Saúde. v. 14, p. 231-235.

Santos, T. G.; Rabelo, R. A. (2012). Composiçao química e avaliaçao da atividade antimicrobiana do óleo essencial das folhas de Piper malacophyllum (C. PRESL.) C. DC. Quim. Nova, v. 35, n. 3, 477-481.

Silva, E.V.C.; Silva, G.F.; Joele, M.R.S.P. (2009). Avaliaçao da utilizaçao de óleo essencial e oleorresina de Pimenta-do-Reino (Piper nigrum L.) em salsicha de frango. Revista Brasileira de Tecnología Agroindustrial, v.1, n.2, p.48-60.

Silva, A. A.; Anjos, M. M.; Ruiz, S. P.; Panice, L. B.; Mikcha, J. M. G.; Manchinski Júnior, M.; Abreu FILHO, B. A. (2015). Avaliaçao da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais de Thymus vulgaris (tomilho), Syzygium aromaticum (cravo-da-índia) e Rosmarinus officinalis (alecrim) e dos conservantes benzoato de sódio e sorbato de potássio em Escherichia coli e Staphylococcus aureus. B.CEPPA, Curitiba, v. 33, n. 1, p. 111-117.

Simôes, C.M.O. & Spitzer, V. Óleos essenciais. Porto Alegre/ Florianópolis. Ed. UFRGS/UFSC, 1999, p. 387- 415.

Simôes, C.M.O.; Schenkel, E.P.; Gosmann, G.; Mello, J.C.P.; Mentz, L.A.; Petrovick, P.R. (1999). Farmacognosia: da planta ao medicamento. Porto Alegre: Ed. da UFSC.

Souza Filho, A. P. S.; Bayma, J. C.; Guilhon, G. M. S. P.; Zoghbi, M. G. B. (2009). Atividade potencialmente alelopática do óleo essencial de Ocimum americanum. Planta Daninha, Viçosa, v. 27, n. 3, p.499-505.

Stoyanova, A.; Denkova, Z.; Nevov, N.; Slavchev, A.; Jirovetz, L.; Buchbauer, G.; Lien, H. N.; Schimidt, E.; Geissler, M. (2006). C2H2F4-Oleoresins of Black Pepper (Piper nigrum L.) and Ginger (Zingiber officinale (L.) Rosc.) from Vietnam: Antimicrobial Testings, Gas Chromatographic Analysis and Olfactoric Evaluation. Electronic. Journal of Environmental, Agricultural and Food Chemistry, v. 5, n. 6.

Trajano, V. N.; Lima, E. O.; Souza, E. L.; Travazos, A. E. R. (2009) Propriedade antibacteriana de óleos essenciais de especiarías sobre bacterias contaminantes de alimentos. Ciencia Tecnología de Alimentos, Campinas, v. 29, p. 542-545.

Yazgan, H., (2020). Investigation of antimicrobial properties of sage essential oil and its nanoemulsion as antimicrobial agent, LWT - Food Science and Technology, doi: https:// doi.org/10.1016/j.lwt.2020.109669.

Zacario, P.C; Piletti, R.R. Estudo da propriedade antimicrobiana dos óleos essenciais de alho (allium sativum), pimenta do reino (piper nigrum) e pimenta rosa (schinus molle) para aplicaçao em cortes de frango temperados. Trabalho de Conclusio de Curso do curso de Tecnologia de Alimentos da Universidade do Extremo Sul Catarinense. 2013. Disponível em: <http://repositorio.unesc.net/bitstream/1/1808/1/Paula%20Choseck%20Zacar%C3%A3o.pdf >. Acesso em: 10 de maio, 2020.