EFECTO DE LA FERMENTACIÓN CON RHIZOPUS ORYZAE SOBRE EL CONTENIDO DE ALMIDÓN Y OTROS PARÁMETROS FISICOQUÍMICOS DE GRANOS DE SORGO/EFFECT OF SOLID STATE FERMENTATION BY RHIZOPUS ORYZAE ON SORGHUM GRAINS STARCH CONTENT AND OTHER PHYSICOCHEMICAL PARAMETERS

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RESUMEN

Antecedentes: El efecto de la fermentación sólida de granos de cereales con hongos de la especie Rhizopus oryzae sobre el contenido de almidón, proteínas y azúcares totales ha sido estudiado por muy pocos autores, aun siendo estos aspectos de suma importancia para la viabilidad de la implementación de tecnologías fermentativas en la industria de alimentos. Objetivos: El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la fermentación de granos de sorgo (Sorghum bicolor L. Moench) con Rhyzopus oryzae (MUCL 28168), sobre el contenido de almidón y otros parámetros fisicoquímicos (pH, proteína, azúcares totales y la producción de dióxido de carbono). Métodos: Se evaluó el efecto de la temperatura (28, 32 y 36°C) sobre el contenido de almidón de los granos de sorgo después de 32 horas de fermentación en bio-reactores en columnas tipo Raimboult. Se escogió el nivel de temperatura que permitió obtener la mayor degradación de proteínas y se llevó a cabo una cinética de fermentación de 32 horas. Cada 4 horas se evaluó el valor del pH, el contenido de almidón, proteínas, azúcares totales y la producción de dióxido de carbono. Resultados: Se encontró que el hongo R. oryzae (MUCL 28168) fue capaz de degradar mayor cantidad de almidón estando expuesto a la temperatura límite de su rango óptimo de crecimiento y que tiene la capacidad de llevar a cabo una Fermentación y Sacarificación Simultánea (SSF), ya que el contenido de azúcares totales aumentó tenuemente durante la mayor parte del tiempo de tratamiento. El contenido de proteínas aumentó hasta las 28 horas de fermentación, luego de lo cual presentó un descenso acompañado de un aumento en el valor del pH. La respiración del hongo medida como producción de CO2 aumento incesantemente durante todo el proceso fermentativo, indicando que se desarrolló y mantuvo su actividad metabólica durante las 32 horas de fermentación. Conclusiones: La fermentación sólida de granos de sorgo con R. oryzae (MUCL 28168) tuvo un efecto significativo en los diferentes parámetros fisicoquímicos estudiados.

Palabras clave: Fermentación, sorgo, almidón, proteína, azúcares totales.

ABSTRACT

Background: The effect of solid state fermentation by Rhizopus oryzae on cereal grains starch content, protein and total sugar has been studied by few researchers, but there are too important aspects about the feasibility of applying fermentative technologies in food industry. Objectives: The objective of this study was to evaluate the effect of fermentation by Rhyzopus oryzae (MUCL 28168) on sorghum (Sorghum bicolor L. Moench) starch content and other physicochemical parameters (pH value, protein, total sugar and carbon dioxide production. Methods: The effect of temperature (28, 32 y 36°C) on sorghum starch content after 32 hours of fermentative process on Raimbault columns was evaluated. The best temperature was chosen to 4 hours the pH value, starch content, protein, total sugar and carbon dioxide production were determinated. Results: R. oryzae (MUCL 28168) was able to reduce starch content much better at 36°C and it had the capacity to perform a Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF), as the total sugar content increased dimly during most of the fermentation time. Conclusions: The solid state fermentation by R. oryzae (MUCL 28168) had a significant effect on the physicochemical parameters studied.

Keywords: Fermentation, sorghum, starch, protein, total sugar.

INTRODUCCIÓN

El sorgo es uno de los cereales más comunes en el mundo y en la mayoría de los países se destina principalmente para alimentación animal (1). En los últimos años ha cobrado interés su uso para la alimentación humana, perfilándose como una materia prima potencial para la producción de bebidas y alimentos; interés que se debe principalmente a su bajo costo de producción, resistencia a la sequía, características nutricionales, actividad antioxidante, entre otros (2, 3).

La fermentación en estado sólido (SSF), se define como el crecimiento de microorganismos en medios húmedos, donde el agua está retenida en el sustrato y no fluye libremente (4). A diferencia de la fermentación líquida, ésta resulta simple, económica y de bajo costo energético (5). El uso de SSF se extiende desde la producción de aromas/sabores y enzimas (6), hasta la degradación de factores anti-nutricionales como taninos, saponinas, etc., presentes en muchos alimentos (6, 7, 8). Entre los microorganismos usados para la SSF se encuentra el Rhizopus oryzae, el cual produce un conjunto de enzimas que juegan un papel crucial en la hidrólisis del almidón y otros compuestos químicos, dando lugar a ácido láctico, etanol, entre otros, que cumplen un papel importante en la conservación de los alimentos (9).

Esta investigación tuvo como objetivo evaluar el efecto de la fermentación sólida de sorgo (Sorghum bicolor L. Moench) con Rhyzopus oryzae (MUCL 28168), sobre el contenido de almidón y otros parámetros fisicoquímicos (pH, contenido de proteínas, azúcares totales y producción de CO2).

MATERIALES Y MÉTODOS

Adecuación de la materia prima

Se utilizaron granos de sorgo (Sorghum bicolor L. Moench) que pasaron a través de la malla N° 16 de la serie Tyler (diámetro de partícula igual a 1.00 mm).

Preparación del inóculo

Para inocular las muestras de sorgo se utilizó Tane-koji. Éste se elaboró incorporando las esporas en suspensión del R. oryzae (MUCL 28168), en una concentración de 7×107 esporas/mL en arroz integral. Una vez el hongo creció y esporuló, se licuó dicha matriz y se almacenó en un frasco hermético para su posterior uso.

Fermentación del sorgo a tres temperaturas distintas

Se utilizaron columnas de fermentación (bioreactor en columnas tipo Raimboult) para fermentar el sorgo, incorporando en cada columna una mezcla de 70 g de sorgo seco, 28 g de agua y 1 g de Tanekoji. Todas las columnas se introdujeron en baño de agua termo-regulado y cada una fue expuesta a un flujo de aire de 80 mm3 durante 32 horas. Se evaluó la pérdida de almidón transcurridas 32 horas de fermentación, en función de tres niveles de temperatura: 28°C, 32°C y 36°C. La cinética de fermentación se realizó con la temperatura que permitió obtener mayor porcentaje de pérdida de almidón.

Cinética de fermentación

Se realizó bajo las condiciones descritas en el ítem anterior. Cada 4 horas se extrajo una columna de fermentación del baño de agua termo-regulado y se midieron los parámetros fisicoquímicos de interés en este estudio.

Determinación del pH

Se suspendió 1 g de sorgo en 10 mL de agua destilada durante 20 minutos, conforme a la AOAC 943.02/90 y se efectuó la lectura del pH con un pHmetro (Thermo Scientific Orion StarTM, Estados Unidos).

Contenido de proteínas

Se elaboró por el método de Lowry modificado (Hartree, 1972) (10). Se construyó una curva patrón a partir de las lecturas de absorbancia a 750 nm de una solución de seroalbúmina bovina a diferentes concentraciones.

Contenido de azúcares totales

Los azúcares totales se determinaron por el método de Dubois et al. (1956) (11). Se pesaron 10 g de la muestra en 90 mL de agua destilada estéril, la mezcla se homogenizó y se dejó a 5 °C durante 12 h, al cabo de este tiempo se centrifugó a 3000 rpm por 10 minutos, el sobrenadante se separó y se diluyó en agua destilada, y se procedió conforme al método citado.

Cuantificación de almidón

El método se diseñó con base en la NTC-4566 (12). Se removieron los azúcares presentes en la muestra mezclando con etanol y centrifugando a 2500 rpm durante 5 minutos. Posteriormente, se realizó la extracción y rompimiento de la molécula de almidón usando ácido perclórico al 52% y centrifugando bajo las condiciones mencionadas anteriormente. Seguidamente se realizó la dilución correspondiente en agua destilada y se procedió conforme al método mencionado para la cuantificación de azucares totales, con las siguientes variaciones: la muestra no se congeló ni centrifugó, y la lectura de la densidad óptica a 630 nm. El resultado se reemplazó en la ecuación de la recta de la curva patrón elaborada con glucosa anhidra, se despejó la ecuación, se multiplicó por el factor dilución y por 1.06, que corresponde al factor de conversión de dextrosa en almidón (12).

Cuantificación del dióxido de carbono (CO2) producido por el hongo

Se siguió el método expuesto por Barrena- Gómez (2006) (13) con algunas modificaciones. Se llenó una columna pequeña con sílica-gel y se conectó a uno de los bio-reactores, la cual a su vez se enlazó a un Erlenmeyer que contenía hidróxido de bario 0.2 N. Cada cuatro horas se extrajo una muestra de 10 mL de la solución hidróxido de bario del Erlenmeyer y se diluyó en 50 mL de agua, se adicionaron tres gotas de fenolftaleína y se tituló con ácido oxálico 0.1 N. Se calculó la cantidad de CO2 producido como intensidad respiratoria, conforme al método citado.

Análisis estadístico

La elección de la temperatura más adecuada para llevar a cabo la cinética de fermentación se realizó con base en un ANOVA de un solo factor y una prueba Tukey, con un nivel de confianza del 95%, utilizando Minitab 16. La evaluación de las correlaciones de Pearson entre los parámetros estudiados se hizo con el mismo software y nivel de confianza. Todos los análisis hicieron por triplicado.

RESULTADOS

Efecto de la temperatura

Los porcentajes de pérdida de almidón de los granos de sorgo fermentados con R. oryzae (MUCL 28168), en función de la temperatura a la que se mantuvo el proceso fermentativo, se presentan en la Tabla 1.

La temperatura de fermentación tuvo un efecto significativo en el porcentaje de pérdida de almidón, con un nivel de confianza del 95% (p<0.05). La prueba de comparación de Tukey indicó que el porcentaje de pérdida de almidón a 36°C fue estadísticamente diferente a los otras dos.

Cambios en el valor del pH y contenido de proteínas

Las representaciones gráficas del cambio en el valor del pH y el contenido de proteínas del sorgo a lo largo del proceso fermentativo se muestran en la Figura 1.

Porcentaje de pérdida de almidón y contenido de azúcares totales

Las curvas correspondientes al porcentaje de pérdida de almidón y contenido de azúcares totales de los granos de sorgo, a lo largo del proceso de fermentación, se presentan en la figura 2. Se puede observar un valor máximo de 43.78% de almidón degradado, respecto al contenido inicial (191.57 mg/g de Sorgo húmedo).

Producción de dióxido de carbono (CO2)

La producción de dióxido de carbono por parte del R. oryzae (MUCL 28168) se presenta en la figura 3.

DISCUSIÓN

Dado que la prueba de comparación de Tukey indicó que el proceso fermentativo a 36°C presentaba diferencia significativa con respecto a las otras dos temperaturas, se decidió realizar la cinética de fermentación bajo esa condición.

Ciertos autores reportan que la temperatura óptima de crecimiento para los hongos de la especie R. oryzae oscila alrededor de 30°C (14), no obstante, el R. oryzae (MUCL 28168) presentó mayor eficiencia a 36°C. Esto pudo haber sido causado por factores como el tipo de sustrato en el que creció y la genética propia del microorganismo (14). Lo anterior concuerda con lo reportado por Huang et al., (2005) (15), que estudiaron la fermentación de residuos de almidón de papá con R. oryzae y encontraron que el microorganismo degradó mayor cantidad de almidón a 40°C.

La acidez aumentó durante las primeras 16 horas de fermentación la (Figura 1), debido posiblemente a la actividad de las proteasas y amilasas producidas por el hongo R. oryzae (MUCL 28168) (9, 16), cuando actúan sinérgicamente dan lugar a la formación de ácidos y gas amoníaco, produciendo una eventual decadencia del valor de pH y un posterior ascenso del mismo, tal como reportaron Nnam & Obiakor (2011) (17), en su investigación sobre la fermentación de semillas de baobab, registrando un aumento del pH entre las 24 y 48 horas de fermentación.

Transcurridas cuatro horas desde el inicio de la fermentación y hasta las 24 horas, el contenido de proteínas aumentó drásticamente, ya que probablemente en dicho espacio de tiempo el microorganismo en cuestión empezó a producir metabolitos que degradaron los taninos, liberando las proteínas que se encontraban adheridas a ellos. Esto concuerda con lo reportado por Nnam & Obiakor (2011) (17), que registraron un aumento en el contenido de proteínas durante las primeras 24 horas de fermentación y una disminución del contenido de taninos, atribuyéndolo a la degradación de estos últimos a sustancias simples por la acción de la enzima polifenol oxidasa y al rompimiento del complejo tanino-proteína.

Entre las 28 y 32 horas de fermentación se registró un descenso del contenido de proteínas, dado a que probablemente en ese espacio de tiempo el hongo cambió su metabolismo y empezó a producir altas cantidades de enzimas proteolíticas, para obtener nutrientes a partir de las proteínas (18).

El fuerte aumento en el porcentaje de pérdida de almidón durante las primeras 8 horas pudo ser ocasionado por la actividad amilolítica del hongo, acompañada de una activa degradación de los sacáridos resultantes, en un fenómeno denominado Fermentación y Sacarificación Simultánea, o (SSF) por sus siglas en inglés (15, 19); razón por la que la degradación del almidón a oligosacáridos no tuvo un efecto perceptible en el contenido de azúcares totales (Figura 2). Posteriormente, a las 12 horas de iniciado el proceso, se registró un aumento en el contenido de azúcares totales, acompañado a su vez por una disminución de la tasa de degradación de almidón, debido probablemente al rompimiento del complejo ácido tánico-almidón (17), dejando libre una cantidad considerable de este último que no se perdió en la extracción de compuestos polifenólicos con etanol, cuando se adecuó la muestra en el proceso de cuantificación de almidón. Es importante anotar que dicho aumento en el contenido de almidón también pudo ser el resultado de la degradación de las kafirinas presentes en los granos de sorgo, proteínas que también forman complejos con ese polisacárido (20, 21).

De la figura 3 se puede analizar que el hongo produce CO2 mientras se encuentre metabolizando algún tipo compuestos (8), por lo que se puede afirmar que la respiración es una variable de respuesta que permite predecir la actividad metabólica del microorganismo en cuestión, y cuya pausa podría indicar que el hongo ya no tiene a disposición de nutrientes. Los resultados de la producción de CO2, presentaron una correlación de Pearson con el contenido de proteínas, azúcares totales y el porcentaje de pérdida de almidón igual 0.817, 0.925 y 0.861, respectivamente.

CONCLUSIONES

La temperatura óptima de crecimiento de un hongo no siempre será el valor intermedio dentro dicho rango, como es el caso del R. oryzae (MUCL 28168), ya que ésta se verá afectada por diversos factores tales como la composición del sustrato y la genética propia del hongo.

La fermentación sólida de granos de sorgo con R. oryzae (MUCL 28168) tuvo un efecto significativo en los diferentes parámetros fisicoquímicos estudiados, ocasionando una disminución importante en el contenido de almidón, y un aumento en la concentración de proteínas y azúcares totales presentes en los granos.

References

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