Generation and Characterization of Human Oligodendroglia as Cellular Model for Multiple System Atrophy

Abstract

Multiple system atrophy (MSA) is a rare and devastating movement disorder with a fast progressive and fatal disease course. Patients present a heterogeneous combination of clinical symptoms including parkinsonism, cerebellar ataxia and autonomic failure. The accumulation of alpha - synuclein (aSyn) within oligodendroglial cytoplasmic inclusions (GCIs) is an important neuropathological hallmark of the disease and has been associated with demyelination and widespread neurodegeneration. Myelin is formed by specialized membranes of oligodendrocytes and represents an abundant and crucial structure of the central nervous system. Continuous physiological myelin turnover, adaptive myelination and remyelination are critical for neuronal survival and brain plasticity. Disturbances in the myelin homeostasis result in signal transmission delay, breakdown of metabolic support and ultimately the degeneration of axons and neurons. Although the precise cascade of pathogenic events remains elusive, oligodendrocytes are considered as the primary affected cell type in MSA. Rodent in vitrostudies indicated aSyn as an inhibitor of oligodendroglial maturation and myelination, however, little is known about its impact on human oligodendroglia. A severe myelin deficit is present in MSA brain tissue without a concurrent loss of oligodendrocytes leading to the hypothesis that intracellular accumulation of aSyn interferes with the myelinating capacity of oligodendrocytes.

A human cellular model for MSA was established to address this hypothesis. Human induced pluripotent stem cells were derived from healthy donors and oligodendroglial lineage specification induced by the ectopic expression of the oligodendroglial transcription factors OLIG2, SOX10, and NKX6.2. Oligodendroglial identity and terminal maturation was confirmed by a thorough phenotypical characterization based on transcriptional, morphological and metabolome analyses. Notably, a profound upregulation of the lipid metabolism during in vitro differentiation of human oligodendrocytes was identified by applying liquid chromatography - tandem mass spectrometry. Ultimately, oligodendrocytes ensheathed inert nanofibers in vitro supporting a myelinating potential of these cells. The origin of aSyn in GCIs is controversially debated. Human oligodendrocytes expressed aSyn and incorporated recombinant aSyn from the supernatant, which corroborates both, an endogenous and exogenous origin of aSyn.

Lentiviral particles were used to increase intracellular levels of aSyn. Accumulating aSyn was distributed across the cell with an enrichment in the perinuclear cytoplasm, yet without forming GCI - like inclusions. The differentiation into oligodendroglial lineage cells was not affected by aSyn and myelin gene expression was largely preserved except for a decline in transcripts of the mature myelin basic protein. Nevertheless, aSyn accumulation led to a myelin deficit in vitro. Oligodendrocytes extended less primary processes to ensheath nanofibers while the length of individual myelin - like segments was unaltered or even increased. A significant number of aSyn expressing oligodendrocytes presented an immature morphology despite immunoreactivity for the mature myelin basic protein. Morphological changes were accompanied by an increase in actin filaments and cell body enlargement. Actin remodeling is a critical event during oligodendroglial differentiation and myelination. Membrane protrusion and process outgrowth require the local assembly of actin bundles, however widespread polymerization acts as physical barrier and increases membrane tension. No effects of aSyn on cell body stiffness were identified, but a profound reduction in Ermin expression. Considering the role of Ermin in cytoskeletal remodeling and myelin maintenance, the transcriptional repression of Ermin provides a potential link between altered actin dynamics, reduced process outgrowth and myelin deficits.

Alternate abstract:

Die Multisystematrophie (MSA) ist eine seltene Bewegungsstörung mit einem schnell - fortschreitenden und letalem Verlauf. Die klinischen Symptome können sehr heterogen sein und umfassen neben Parkinson - ähnlichen Symptomen auch zerebellare ataktische Störungen sowie eine schwere autonome Dysfunktion. Die Anreicherung von alpha - Synuclein (aSyn) in oligodendroglialen zytoplasmatischen Einschlüssen (GCIs) stellt ein wichtiges neuro-pathologisches Merkmal dar, welches darüber hinaus mit einem ausgeprägten Myelinverlust und einer weitreichenden Neurodegeneration in Verbindung gebracht wurde. Myelin ist ein essenzieller Bestandteil des Zentralnervensystems. Es wird durch spezialisierte Membranen von Oligodendrozyten gebildet. Ein kontinuierlicher Myelinumsatz, sowie adaptive Myelinisierung und Remyelinisierung sichert das Überleben von Neuronen und trägt zu einer lebenslangen Anpassungsfähigkeit des Gehirns bei. Störungen in der Myelinhomöostase führen zu einer verzögerten Signalübertragung, einer verringerten metabolischen Unterstützung und ultimativ zu degenerativen Veränderungen von Axonen und Neuronen. Obwohl der genaue Ablauf pathogener Ereignisse nicht bekannt ist, werden in der MSA Oligodendrozyten als der primär betroffene Zelltypus angesehen. Murine Zellkulturstudien deuten darauf hin, dass aSyn die Ausreifung von Oligodendrozyten sowie das Ausbilden von Myelinscheiden beeinträchtigt. Über die Auswirkungen auf humane Oligodendroglia ist jedoch wenig bekannt. Neuropathologisch zeigt sich ein schweres Myelindefizit in MSA Gehirnen, jedoch ohne einen proportional dazu vergleichbaren Verlust an Oligodendrozyten. Dies führte zu der Hypothese, dass die Myelinsierungskapazität von Oligodendrozyten durch die intrazelluläre Anreicherung von aSyn beeinträchtig wird.

Es wurde ein humanes Zellkulturmodell für die MSA generiert, um diese Hypothese zu untersuchen. Dafür wurden humane induzierte pluripotente Stammzellen von gesunden Spendern generiert und die oligodendrogliale Differenzierung durch eine ektopische Expression der oligodendroglialen Transkriptionsfaktoren OLIG2, SOX10 und NKX6.2 induziert. Die Differenzierung sowie das Ausreifen von Oligodendrozyten wurde durch eine detaillierte phänotypische Charakterisierung bestätigt. Neben Expressionsanalysen wurde auch morphologische und metabolomische Untersuchungen durchgeführt. Während der Differenzierung humaner Oligodendrozyten wurde mittels Flüssigkeitschromatographie und Tandem - Massenspektrometrie eine starke Zunahme des Lipidstoffwechsels festgestellt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Oligodendrozyten inerte Nanofasern umhüllen und daher ein Myeliniserungspotential besitzen. Der Ursprung von aSyn in GCIs wird kontrovers diskutiert. Humane Oligodendrozyten exprimierten aSyn und nahmen rekombinantes aSyn aus dem Überstand auf, wodurch die Annahme eines endogenen als auch eines exogenen Ursprungs nachvollziehbar erscheint.

Lentivirale Partikel wurden genutzt, um die intrazelluläre aSyn Konzentration zu erhöhen. Das exprimierte aSyn verteilte sich über die gesamte Zelle, reicherte sich jedoch im perinukleären Zytoplasma an. Es wurden keine GCI - ähnlichen Einschlüsse gebildet. Die Differenzierung zu Oligodendrozyten wurde durch aSyn nicht beeinträchtig und die Expression von Myelin - assoziierten Genen blieb überwiegend konstant. Eine Ausnahme stellte dabei das basische Myelinprotein (MBP) dar, bei dem sich weniger Transkripte zeigten. Zusätzlich konnte ein Myelindefizit festgestellt werden. Oligodendrozyten bildeten weniger Fortsätze aus, um Nanofasern zu umhüllen. Die Länge einzelner Myelin - ähnlicher Segmente blieb dabei jedoch unverändert oder nahm sogar zu. Eine Vielzahl von aSyn exprimierenden Oligodendrozyten zeigte eine unreife Morphologie, trotz positiver Färbung für das reife Myelinprotein MBP. Neben den morphologischen Veränderungen, konnte auch eine Zunahme an Aktinfilamenten und eine Zellvergrößerung beobachtet werden. Die Restrukturierung des Aktin - Zytoskeletts ist eine wichtige Voraussetzung für die Differenzierung von Oligodendrozyten und die Bildung von Myelinscheiden. Die lokale Ausbildung von Aktinbündeln begünstigt die Bildung von Membranausstülpungen und fördert das Wachstum von Fortsätzen. Eine diffuse und weitreichende Polymerisierung von Aktin stellt dagegen eine physikalische Barriere dar und trägt zu einer erhöhten Zellmembranspannung bei. Eine Anreicherung von aSyn führte nicht zu einer Versteifung der Zellen, jedoch konnte eine verminderte Expression von Ermin ermittelt werden. Das Protein Ermin ist an der Umstrukturierung von Aktin sowie der Aufrechterhaltung von Myelinscheiden beteiligt. Die verminderte Expression stellt daher eine mögliche Verbindung zwischen einer veränderten Aktin - Dynamik, einer reduzierten Fortsatzbildung und Myelindefiziten dar. .