Investigation of Gravitaxis-Dependent Proteins in Euglena Gracilis, Particularly a Certain Proteinkinase A

Abstract

Euglena gracilis ist ein einzelliger Süßwasserflagellat und bewegt sich vorwiegend negativ gravitaktisch (Aufwärtsbewegung der Zelle entgegen dem Schwerkraftvektor), um eine optimale Position in der Wassersäule für die Photosynthese, das Wachstum und die Reproduktion zu erreichen. Der vermutliche Signalweg für die Gravitaxis in Euglena gracilisbeginnt, indem Kraft auf die untere Membran wirkt, weil die Zellen eine horizontale Schwimmbewegung durchführen. Dadurch kommt es zur Öffnung von mechano-sensitiven Kanälen und einem Ionenstrom, was wiederum eine Veränderung des Membranpotentials bewirkt. Anschließend wird Calmodulin 2 durch Calcium stimuliert, welches wiederum vermutlich eine Adenylatzyklase aktiviert, die cAMP aus ATP synthetisiert. Danach wird die Proteinkinase A durch dieses cAMP stimuliert und phosphoryliert weitere Proteine, die am Geißelschlag beteiligt sind. Aus diesem Grund wurde die Proteinkinase A im Zusammenhang mit Veränderungen der Schwerkraft untersucht. Zusätzlich erfolgten erstmalige Proteomanalysen von Euglena gracilismittels Massenspektrometrie, um ein besseres Verständnis, was durch den Einfluss der Schwerkraft in der Zelle passiert, zu erlangen.

Während des Parabelfluges kam es innerhalb der ersten Parabel ausschließlich in der zweiten Hypergravitationsphase zu Veränderungen in der Phosphorylierung der PKA, während in der letzten Parabel keine Veränderungen der Phosphorylierung mehr beobachtet werden konnten. Innerhalb des zweistündigen Parabelfluges konnte eine Abnahme der PKA und eine leichte Zunahme der Phosphorylierung der PKA nach den 31 Parabeln verzeichnet werden. Dies könnte auf mögliche Adaptationseffekte hindeuten. Bei der Proteomanalyse waren 22 Proteine signifikant verändert, wovon 8 Proteine wiederholt auftraten. Dabei zeigten sich fast identische Proteinveränderungen in den einzelnen Phasen der Parabel 1, welche primär hochreguliert waren. Diese Proteine sind an der Translation, Phosphorylierung, Citratzyklus und Zellteilung beteiligt. Ferner konnte HSP70 (herunterreguliert) identifiziert werden. Nach zwei Stunden kam es zu einer Hochregulation einer Glutamatdehydrogenase, welche als Stressindikator fungiert.

Beim MAXUS-Flug waren bei 0,02 und 0,04 x g keine Veränderungen des gravitaktischen Verhaltens und der Proteinkinase A gegeben. Bei einem Beschleunigungslevel von 0,08 x g konnte eine Zunahme der Präzision der Orientierung der Zellen sowie eine Veränderung der PKA und deren Phosphorylierung beobachtet werden. Somit konnte auch der Schwellenwert von Euglena gracilis für die Wahrnehmung der Schwerkraft näher präzisiert werden. Bei 0,16 x g zeigten sich erneut keine Veränderungen im PKA-Gehalt. Bei der Proteomanalyse waren 34 Proteine signifikant verändert, davon traten 9 Proteine wiederholt auf. Unter Schwerelosigkeit Zusammenfassung 9 waren die Proteine primär hochreguliert und an der Fettsäure-Biosynthese, Intrazellulärer Proteintransport, Mannitol-Metabolismus (unterstützt bei osmotischen Stress), Translation sowie Phosphorylierung beteiligt. Ab dem niedrigsten Beschleunigungslevel über den gesamten Flug konnte eine Herunterregulation des 86 kDa Articulins in Euglena gracilisbeobachtet werden. Bei 0,02 und 0,04 x g kam es zu Veränderungen von Proteinen, die an Citratzyklus, Phosphorylierung und Photosynthese beteiligt sind. Ab dem nächsten Beschleunigungslevel von 0,08 x g kam es zu einer 2-fachen Hochregulation von Proteinen für die Phosphorylierung und Photosynthese (PS II). In der letzten Beschleunigungsphase konnten am wenigsten signifikant veränderte Proteine beobachtet werden, wovon primär herunterregulierte Proteine (Translation) auftraten.

Alternate abstract:

Euglena gracilis is a single-cell freshwater flagellate and shows an upward movement against the gravity vector to achieve an optimal position in the water column for photosynthesis, growth and reproduction. The current model of gravitaxis in Euglena gracilis begins with a force acting on the lower membrane because the cells perform a horizontal swimming pattern. The force activates mechano-sensitive ion channels and the resulting ion influx changes the membrane potential. Subsequently, calmodulin 2 is stimulated by calcium, which in turn probably activates an adenylate cyclase, which synthesizes cAMP from ATP. Thereafter, protein kinase A is stimulated by cAMP, which phosphorylates other proteins involved in changes of the flagellar beating pattern. For this reason, protein kinase A has been studied with respect to changes in gravity. In addition, the first proteome analyzes in Euglena graciliswere performed by mass spectrometry to get a better understanding about what happens in the cell through the influence of gravity.

During the parabolic flight, changes in the phosphorylation of PKA were only observed in the second hypergravity phase of the first parabola. However, no changes of the phosphorylation was detected in the last parabola. Looking at the total parabolic flight, a decrease in PKA and a slight increase in phosphorylation of PKA were observed after the 31 parabolas (2 hours). This could be due to possible adaptation effects. In proteome analysis, 22 proteins were significantly altered, of which eight proteins are occurred repeatedly. Almost identical protein changes were found in the three different phases of parabola 1, which were primarily upregulated. These proteins are involved in translation, phosphorylation, citrate cycle and cell division. HSP70 was found to be downregulated. After 2 hours, there was an upregulation of a glutamate dehydrogenase, which acts as a stress indicator.

During the MAXUS flight, no changes were detected at 0.02 and 0.04 x g, neither in gravitational behavior nor in the amount of protein kinase A. At the acceleration level of 0.08 x g, an increase in the precision of orientation of the cells as well as a change in PKA and its phosphorylation could be observed. Thus, the threshold of Euglena gracilis for the perception of gravity could be specified more precisely. There was no change in the PKA content at 0.16 x g. In proteome analysis, 34 proteins were significantly altered, of which nine proteins are occurred repeatedly. Under weightlessness, the proteins were primarily upregulated and involved in fatty acid biosynthesis, intracellular protein transport, mannitol metabolism (involved in osmotic stress), translation and phosphorylation. At any acceleration level over the entire flight, a downregulation of the 86-kDa articulin in Euglena graciliswas observed. At 0.02 and 0.04 x g, protein changes are involved in Abstract 11 the citrate cycle, phosphorylation and photosynthesis. At 0.08 x g, there was a twofold upregulation of proteins for phosphorylation and photosynthesis (PS II).