Bioengineering an Immunomodulatory Microenvironment for Bone Healing

Abstract

Inflammation is a process that occurs naturally after injury. While acute inflammation is beneficial in the regulation of bone healing, chronic inflammation is detrimental and underlies most musculoskeletal diseases. Tuning inflammation using biomaterials is a strategy increasingly explored to promote tissue repair/regeneration. In particular, the modulation of macrophage phenotype, from pro-inflammatory (M1) to pro-regenerative (M2), has the potential to direct appropriate healing outcomes.

For this doctoral dissertation work, the goal was to use biodegradable biomaterials to bioengineer a microenvironment that could modulate macrophages towards a proreparative phenotype to improve bone healing. Particularly, we hypothesized that the combination between fibrinogen (Fg) and magnesium (Mg) would act synergistically in the modulation of macrophage phenotype and their crosstalk with mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), under physiological and pro-inflammatory conditions. Fg has been investigated in our group either adsorbed to chitosan or as scaffolds with very encouraging results for bone regeneration. On the other hand, Mg is considered the most promising biodegradable biomaterial to be used in orthopedics due to its mechanical properties similar to human bone and natural presence in bone. However, its degradation rate is fast and hard to control. Thus, the combination of Mg-based materials with polymers has been suggested as an attractive approach for orthopedic implants, to improve biodegradability rate, biocompatibility, angiogenesis and osteogenesis. So, herein, we aimed to: (i) combine Fg with Mg and investigate the synergistic immunomodulatory potential of FgMg biomaterials towards macrophages and MSCs; (ii) develop Mg-incorporated Fg scaffolds and evaluate their capacity to modulate macrophage phenotype and inflammation, in vitro and in vivo;(iii) determine the potential of non-viral transfection to fine-tune biomaterials ability to modulate macrophage polarization.

To accomplish our aims we started by combining Fg scaffolds with Mg discs (multilayer constructs). Then, we investigated the impact of their extracts on macrophage phenotype and paracrine crosstalk with MSCs. Results showed that extracts from FgMg materials impair LPS-IFNy-driven macrophage M1 polarization, resulting in a lower percentage of CD86 positive cells, and reduced secretion of TNF-⍺ and IL-12. Mechanistically, FgMg extracts impaired the LPS-IFNy stimulation of NF-kB p65 activation. Moreover, the secretome from macrophages exposed to FgMg extracts significantly increased the MSCs ALP activity. These findings are reported in chapter II and published in the scientific article Bessa-Gonçalves M et al. (2020), Acta Biomaterialia, 114 (2020) 471–484.

Next, we developed an FgMg combination biomaterial, where increasing concentrations of MgSO₄ were incorporated in the structure of Fg 3D scaffolds. Results showed that Fg scaffolds incorporating 10, 25 and 50 mM of MgSO4 presented decreasing porosity with increasing MgSO₄ concentration. MgSO₄ incorporation increased surface charge, and gradual Mg²⁺ release could be detected along time. MgSO₄ incorporation also increased the loss and storage modulus of Fg, with significant differences for the 10 mM FgMgSO₄ scaffolds. When macrophages were cultured on these scaffolds, a significant decrease in cell viability was observed for 25 and 50 mM FgMgSO₄scaffolds, either in M0 or M1 conditions.

Alternate abstract:

A inflamação é um processo que ocorre naturalmente após uma lesão. Embora uma inflamação aguda seja benéfica na regulação da cicatrização óssea, a inflamação crónica é prejudicial e está subjacente à maioria doenças músculo-esqueléticas. O uso de biomateriais para regular a inflamação é uma estratégia cada vez mais explorada na promoção da reparação/regeneração do tecido. Em particular, a modulação do fenótipo dos macrófagos, de pro-inflamatórios (M1) para pro-regenerativos (M2), tem sido realçada como uma estratégia adequada para promover um processo de cicatrização adequado.

O trabalho apresentado nesta tese teve como objetivo utilizar biomateriais biodegradáveis para desenvolver um microambiente capaz de modular a ativação dos macrófagos, promovendo um fenótipo pro-regenerativo, de forma a melhorar a cicatrização óssea. Em particular, colocou-se a hipótese de que a combinação entre fibrinogénio (Fg) e magnésio (Mg) atuaria sinergicamente na modulação do fenótipo dos macrófagos e na sua comunicação com células mesenquimais (MSCs), tanto em condições fisiológicas como em condições pro-inflamatórias. O Fg tem sido investigado no nosso grupo em diferentes formulações, incluindo após adsorção a quitosano e sob a forma de esponjas 3D, com resultados muito promissores para a regeneração óssea. Por outro lado, o Mg é considerado o biomaterial biodegradável mais promissor para uso ortopédico devido à similaridade das suas propriedades mecânicas com aquelas que são encontradas no osso, assim como a sua presença natural no osso. Contudo, a sua taxa de degradação é rápida e difícil de controlar. Deste modo, a combinação de materiais à base de Mg com polímeros tem sido sugerida como uma abordagem interessante para implantes ortopédicos devido aos seus efeitos sinérgicos na biodegradabilidade, biocompatibilidade, angiogénese e osteogénese. Neste contexto, foram definidos os seguintes objetivos para esta tese: (i) combinar Fg com Mg e investigar o potencial imunomodulatório sinérgico dos biomateriais de FgMg na função de macrófagos e MSCs; (ii) desenvolver esponjas de Fg incorporadas com Mg e avaliar o seu efeito na modulação da inflamação e do fenótipo dos macrófagos, in vitro e in vivo;(iii) determinar o potencial da transfeção não viral para melhorar a capacidade destes biomateriais na modulação da polarização dos macrófagos.

Para atingir os nossos objetivos, começámos por combinar esponjas de Fg com discos de Mg (produzidas por multicamadas). De seguida, investigamos o impacto dos seus extratos no fenótipo dos macrófagos e na sua comunicação parácrina com MSCs. Os resultados mostraram que os extratos dos materiais FgMg atenuam a polarização M1 dos macrófagos, mediada por LPS-IFNy, resultando numa menor percentagem de células positivas para CD86 assim como numa redução da secreção de TNF-⍺ e IL-12. Simultaneamente, a ativação da NF-kB p65, induzida pelo estímulo com LPS-IFNy, foi afetada pela exposição aos extratos de FgMg. Além disso, o secretoma dos macrófagos que foram expostos aos extratos resultantes da combinação entre Fg e Mg, aumentou significativamente a atividade da ALP das MSCs. Estas evidências estão reportadas no capítulo II e publicados no artigo científico Bessa-Gonçalves M et al. (2020), Acta Biomaterialia 114 (2020), 471–484.