Développement d'une Méthode de Lactamisation pour la Synthèse d'analogues Pontés de l'endothéline-1

Abstract

Les endothélines {ET-1,-2,-3) sont des peptides de 21 acides aminés qui suscite beaucoup d'intérêts puisqu'il sont les plus puissants vasoconstricteurs connus chez l'humain Ces médiateurs possèdent dans leur structure deux ponts disulfures unissant respectivement les cystéines 1-15 et 3-11. Les nombreuses études pharmacologiques sur les endothélines, principalement ET-1, ont permis d'établir que ce peptide est à l'origine de deux réponses distinctes au niveau vasculaire; l'une de vasoconstriction et l'autre de vasodilatation Ces deux types d'effets en réponse à l'ET-1 suggèrent l'existence d'une hétérogénéité de récepteurs. Effectivement, des études pharmacologiques ainsi que le clonage moléculaire démontrent l'existence. de divers sous-types de récepteurs pour les ETs. Chez les mammifères, les mieux connus sont ET_A-R, ET_B-R et ET_C-R. D'autres études suggèrent même l'existence d'autres récepteurs pour I'ET-1 soient ET_B1 ET_B2 ET_AX. etc... La liaison de l'ET-1 à ses récepteurs produit divers effets physiologiques, tel que la modulation du tonus vasculaire, la production d'hormones et une action mitogène. Aussi, il est suggéré que I'ET-1 soit impliquée dans plusieurs pathophysiologies humaines. On lui attribue notamment un rôle important dans les cas d'infarctus du myocarde, de l'insuffisance rénale et de maladies inflammatoires pulmonaires.

Jusqu'à maintenant, plusieurs études de structure-activité ont été entreprises dans le but de connaître le rôle exact et distinct des 21 acides aminés constituant l'ET-1 lors de l'interaction avec son récepteur. Plusieurs observations rapportées jusqu'à présent laissent entrevoir l'implication des 4 Cys de la molécule et des 19 Cys du récepteur. Des analogues de l'ET-1 ayant un des deux ponts disulfures remplacé par un pont lactame ont été conçus par synthèse en phase solide. Ce projet de recherche a pour but de vérifier le rôle des cystéines lors de l'interaction au niveau· moléculaire. Les acides aminés sélectionnés pour substituer les Cys 1, 3, 11 et 15 sont Asp, Glu, Lys et Om. Les diverses combinaisons de résidus formant les ponts ont alors été testées dans le but de vérifier de quelle façon la longueur de ce lien intramoléculaire vient influencer l'activité biologique de ce peptide analogue de I'ET-1. Une méthode de synthèse spécifique a de plus été évaluée, puisque deux stratégies de cyclisation sont nécessaires pour former de façon distincte le pont lactame et le pont disulfure. Une approche avec protection orthogonale est donc utilisée. Cette procédure permet de retirer sélectivement les différents groupes protecteurs.

La méthode de synthèse habituellement utilisée dans notre laboratoire ne convient pas au type d'analogues désirés. Effectivement, nos observations suggèrent une déprotection inattendue du noyau indole du Trp en cours de synthèse. Ce noyau étant instable, il peut donner naissance à plusieurs réactions secondaires. De plus, au cours de la synthèse, plusieurs étapes de couplage ont dû être reprises 2 ou 3 fois, ce qui signifie que le peptide a été mis en contact avec une quantité importante de réactifs. Cette situation a entraîné la production d'espèces nucléophiles, contribuant à diverses réactions secondaires.

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Endothelins (ET-1,-2,-3) are 21 amino acid peptides which arouse much interest since they are the most powerful vasoconstrictors known in humans. These mediators have in their structure two disulphide bridges uniting respectively cysteines 1-15 and 3-11. Numerous pharmacological studies on endothelins, mainly ET-1, have made it possible to establish that this peptide is the source of two distinct responses at the vascular level; one of vasoconstriction and the other of vasodilation These two types of effects in response to ET-1 suggest the existence of a heterogeneity of receptors. Indeed, pharmacological studies as well as molecular cloning demonstrate the existence. of various receptor subtypes for ETs. In mammals, the best known are ETA-R, ETB-R and ETC-R. Other studies even suggest the existence of other receptors for ET-1, namely ETB1, ETB2, ETAX, etc. The binding of ET-1 to its receptors produces various physiological effects, such as the modulation of vascular tone, the production of hormones and a mitogenic action. Also, it is suggested that ET-1 is involved in several human pathophysiologies. It is particularly attributed an important role in cases of myocardial infarction, kidney failure and inflammatory lung diseases.

Until now, several structure-activity studies have been undertaken in order to know the exact and distinct role of the 21 amino acids constituting ET-1 during the interaction with its receptor. Several observations reported so far suggest the involvement of the 4 Cys of the molecule and the 19 Cys of the receptor. Analogs of ET-1 having one of the two disulfide bridges replaced by a lactam bridge have been designed by solid phase synthesis. This research project aims to verify the role of cysteines during the interaction at the molecular level. The amino acids selected to substitute Cys 1, 3, 11 and 15 are Asp, Glu, Lys and Om. The various combinations of residues forming the bridges were then tested with the aim of verifying how the length of this intramolecular bond influences the biological activity of this analog peptide of ET-1. A specific synthetic method was also evaluated, since two cyclization strategies are required to form the lactam bridge and the disulfide bridge separately. An approach with orthogonal protection is therefore used. This procedure makes it possible to selectively remove the various protecting groups.

The synthesis method usually used in our laboratory is not suitable for the type of analogues desired. Indeed, our observations suggest an unexpected deprotection of the indole core of Trp during synthesis. This nucleus being unstable, it can give rise to several side reactions. Moreover, during the synthesis, several coupling steps had to be repeated 2 or 3 times, which means that the peptide was brought into contact with a large quantity of reagents. This situation resulted in the production of nucleophilic species, contributing to various side reactions.