Évaluation des glycosyles hydrolases de streptomyces lividans pour la production d'oligosaccharideas par glycosynthèse

Abstract

Des méthodes efficaces de synthèses d'oligosaccharides ne sont pas disponibles malgré l'importance de cette classe de biomolécules au niveau de plusieurs processus biologiques et en tant qu'agents thérapeutiques. En effet, les méthodes chimiques et enzymatiques via les glycosyltransférases et les glycosidases par le mode de transglycosylation ont été exploitées mais se sont avérées non efficaces pour une production à grande échelle.

Dernièrement, une nouvelle méthode mettant à profit l'utilisation de glycosidases de rétention spécifiquement mutées a été élaborée et semble prometteuse. En effet, parmi les deux résidus d'acide aminé du site actif responsables de l'activité d'hydrolyse (Glu ou Asp), la substitution par une alanine du résidu nucléophilique a pour effet d'inactiver l'activité glycosidique de l'enzyme et du même coup rend possible la synthèse d'oligosaccharides. En conjonction avec un sucre donneur activé de configuration anomérique opposé au substrat normal et en présence d'un sucre accepteur approprié, l'enzyme mutée peut efficacement effectuer la synthèse d'oligosaccharides. D'excellents rendements de synthèse ont été obtenus (> 90%) pour l'enzyme mutée 13- glucosidase/galactosidase d'Agrobacterium (Mackenzie et al., 1998) et l'enzyme mutée 1,3-1,4-13-glucanase de Bacillus licheniformis (Malet et Planas, 1998).

Streptomyces lividans est une bactérie qui produit des glycosidases de rétention dont entre autres les xylanases A, B et C. L'objectif général du projet est de muter spécifiquement ces glycosyles hydrolases et d'évaluer leur capacité à synthétiser des oligosaccharides par cette réaction appelée glycosynthèse. Le résidu catalytique nucléophile des enzymes a donc été substitué par une alanine à 1' aide de la muta genèse dirigée par PCR. Suite à leur production et leur purification, l'activité résiduelle d'hydrolyse des enzymes mutées a été déterminée. Cependant, les résultats ont démontré que chacune des enzymes mutées possèdent une activité résiduelle d'hydrolyse. L'enzyme mutée XlnA2-E236A a présenté l'activité résiduelle d'hydrolyse la plus faible avec une valeur moyenne de 0,02% lorsque comparé à l' enzyme sauvage correspondante. De son côté, l'enzyme mutée XlnC-E85A a démontré une valeur moyenne d'activité résiduelle d'hydrolyse de 0,20%. Quant à l'enzyme mutée XlnB2-E8?A, des valeurs beaucoup plus élevées s'élevant jusqu'à 11,9% ont été obtenues.

Non disponible commercialement, le sucre donneur activé nécessaire à la réaction de glycosynthèse a par ailleurs été synthétisé. Parmi les nombreuses synthèses effectuées, seulement deux ont menées au sucre donneur activé 1-fluoroxylobiose. Des rendements très faibles, soit de 1,1% et 1,3%, ont cependant été obtenus. La première synthèse a fournit le sucre donneur fluoré sous une forme brute tandis qu'une forme pure a été obtenue lors de la seconde synthèse. Une première série de tests de glycosynthèse des enzymes mutées a été effectuée avec le sucre donneur fluoré sous forme brute et différents sucres accepteurs. Seules les enzymes mutées XlnA2-E236A et XlnB2-E8? A lorsque mises en présence du sucre donneur fluoré et du sucre accepteur xylotriose ont démontré, mais à un niveau très faible, un phénomène de synthèse. Par contre, ces résultats n'ont pu être reproduits lors de la seconde série de tests de glycosynthèse avec le sucre donneur fluoré sous forme pure.

Abstract (AI English translation)

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Efficient methods for the synthesis of oligosaccharides are not available despite the importance of this class of biomolecules in several biological processes and as therapeutic agents. Indeed, chemical and enzymatic methods via glycosyltransferases and glycosidases by transglycosylation mode have been exploited but proved to be ineffective for large-scale production.

Recently, a new method taking advantage of the use of specifically mutated retention glycosidases has been developed and seems promising. Indeed, among the two amino acid residues of the active site responsible for the hydrolysis activity (Glu or Asp), the substitution by an alanine of the nucleophilic residue has the effect of inactivating the glycosidic activity of the enzyme and at the same time makes possible the synthesis of oligosaccharides. In conjunction with an activated donor sugar of anomeric configuration opposite to the normal substrate and in the presence of an appropriate acceptor sugar, the mutated enzyme can efficiently effect oligosaccharide synthesis. Excellent synthetic yields were obtained (>90%) for the mutated enzyme 13-glucosidase/galactosidase from Agrobacterium (Mackenzie et al., 1998) and the mutated enzyme 1,3-1,4-13- glucanase from Bacillus licheniformis (Malet and Planas, 1998).

Streptomyces lividans is a bacterium that produces retention glycosidases including, among others, xylanases A, B and C. The general objective of the project is to specifically mutate these glycosyl hydrolases and to assess their ability to synthesize oligosaccharides by this reaction called glycosynthesis . The nucleophilic catalytic residue of the enzymes was therefore substituted with an alanine using PCR-directed mutagenesis. Following their production and purification, the residual hydrolysis activity of the mutated enzymes was determined. However, the results demonstrated that each of the mutated enzymes possess residual hydrolysis activity. The mutated XlnA2-E236A enzyme exhibited the lowest residual hydrolysis activity with an average value of 0.02% when compared to the corresponding wild-type enzyme. For its part, the mutated enzyme XlnC-E85A demonstrated an average value of residual hydrolysis activity of 0.20%. As for the mutated enzyme XlnB2-E8?A, much higher values of up to 11.9% were obtained.

Not commercially available, the activated donor sugar necessary for the glycosynthesis reaction has also been synthesized. Of the many syntheses performed, only two led to the activated donor sugar 1-fluoroxylobiose. Very low yields, ie 1.1% and 1.3%, were however obtained. The first synthesis provided the fluorinated donor sugar in a crude form while a pure form was obtained during the second synthesis. A first series of glycosynthesis tests of the mutated enzymes was carried out with the fluorinated donor sugar in crude form and various acceptor sugars. Only mutated enzymes XlnA2-E236A and XlnB2-E8? A when placed in the presence of the fluorinated donor sugar and the xylotriose acceptor sugar demonstrated, but at a very low level, a phenomenon of synthesis. On the other hand, these results could not be reproduced during the second series of glycosynthesis tests with the fluorinated donor sugar in pure form.