The Role of Nematode P-Glycoproteins in the Mechanism of Macrocyclic Lactone Resistance

Abstract

Control of veterinary and human parasitic nematodes relies heavily on chemotherapy with anthelmintics but drug resistance is a growing problem. Against the widely used macrocyclic lactones (MLs), drug resistance has emerged in several nematode species and this is a particular challenge in parasites of ruminants and horses. For instance, ML resistance is globally widespread in an important pathogen of foals, Parascaris univalens. In order to find a sustainable solution for this problematic trend, several strategies have been proposed with the aim of maintaining susceptibility or reversing resistance. These strategies focus on optimized treatment and hygiene regimens guided and complemented by reliable resistance diagnosis and improved farm management. For their implementation, a good knowledge of the underlying resistance mechanisms is considered imperative. However, the underlying mechanisms of ML resistance are mostly unknown. In the last decade, considerable efforts have helped to functionally validate several candidate genes and to better understand some aspects of the genetic basis of ML resistance at the genomic and transcriptomic level. Although uncertainty remains, the ATP-binding-cassette (ABC)-transporters and particularly members of the ABCB subfamily, the P-glycoproteins (Pgps), have been proposed as contributors to ML resistance in several nematode species. The Pgp gene family in nematodes contains several different orthologous lineages but which Pgp genes play a role in ML resistance and how, is unknown.

In a first step, the complete Pgp repertoire in the horse roundworm P. univalens was characterized by transcriptome-guided RT-PCR and Sanger sequencing. This allowed a considerable improvement of the annotation of a total of ten identified Pgp genes including an ascarid specific lineage and two gene duplications with subsequent divergence. Overall, this is a similarly sized repertoire compared to other nematodes, but the phylogenetic analysis revealed that the repertoire of Pgp lineages varies considerably between species. Using a diverse set of transcriptome resources, the tissue expression patterns of all P. univalens Pgp genes were characterized in P. univalens and in the model nematode Caenorhabditis elegans. In both species, expression of Pgps was predominant in the intestine, moderate in the epidermis or carcass tissue (in P. univalens, containing the epidermis, neurons, muscles and the pharynx) and low in the gonads. No indicibility of individual P. univalens Pgp expression was found by examining a novel transcriptome generated from adult P. univalens incubated with ivermectin (IVM, a commonly used ML and an avermectin) or a control. Taken together, the two examined independent P. univalens transcriptome data sets showed that PunPgp-9 and PunPgp-11.1 were the most strongly expressed genes followed by PunPgp-16.1 and -2. These analyses provide a basis for future studies with a focus on selected candidate Pgps.

To investigate the function of Pgps in nematodes and to examine which anthelmintics fall into the substrate range of Pgps, heterologous expression of P. univalens Pgps in different model organisms was employed. Two selected and phylogenetically distant P. univalens Pgps, PunPgp-9 and PunPgp-2, were examined for their ability to transport IVM, an ML, or thiabendazole, a benzimidazole, which is both an antimycotic and anthelmintic, by heterologous expression in an ABC-transporter deletion Saccharomyces cerevisiae strain. The results of this previously established assay, indicated that IVM, but not thiabendazole, is a conserved substrate of both examined Pgps.

Alternate abstract:

Die Strategie zur erfolgreichen Bekämpfung von Infektionen mit parasitischen Nematoden beruht hauptsächlich auf chemotherapeutischer Intervention mit Anthelmintika, doch die Verbreitung von Resistenzen bereitet ein zunehmendes Problem. Gegen die häufig eingesetzten makrozyklischen Lactone (MLs) bestehen Resistenzen bereits in einer Reihe von parasitischen Nematoden und insbesondere bei Parasiten von Pferden und Wiederkäuern ist diese Entwicklung eine Herausforderung. Die ML Resistenz im pathogenen Pferdespulwurm Parascaris univalens beispielsweise, ist global weit verbreitet. Die aktuellen Empfehlungen für eine nachhaltige Parasitenbekämpfung bauen daher auf optimierte und gezielte Behandlungsund Desinfektionsstratgien, welche durch verbesserte Diagnosestellung und nachhaltiges Betriebsmanagement geleitet werden. Ein gutes Verständnis der zugrundeliegenden Resistenzmechanismen ist für die Umsetzung dieser Strategien unabdingbar, jedoch sind die ML Resistenzmechanismen immer noch weitgehend unbekannt. In den letzten Jahren konnten allerdings auf funktionaler, genomischer und transkriptomischer Ebene wesentliche neue Erkenntnisse gewonnen werden. Dabei zeigte sich, dass insbesondere die P-glycoproteine (Pgps) mögliche Kandidatengene für die ML Resistenz darstellen. Diese zur Subfamilie B gehörenden ATP-binding-cassette (ABC)-Transporter bilden bei Nematoden eine Genfamilie mit verschiedenen orthologen Linien, doch welche Pgps für die ML Resistenz relevant sind und wie diese Transporter zur Resistenz beitragen, ist unklar.

In der vorliegenden Arbeit wurde durch Transkriptom-geleitete RT-PCR und SangerSequenzierung das gesamte Pgp-Repertoire des Pferdespulwurms P. univalens charakterisiert und entschlüsselt. Dabei wurde die genomische Annotation der zehn identifizierten Pgps erhebliche gegenüber der ursprünglichen automatischen Annotation verbessert. Damit ist die Anzahl von Pgp Genen ähnlich wie bei anderen Nematoden. Die phylogenetische Analyse zeigte aber auch, dass die Zusammensetzung der Pgp Gene zwischen den Nematodenspezies voneinander abweicht. Auf Basis verfügbarer Transkriptomdaten wurden die Gwebeexpressionsprofile der einzelnen Pgps in dem Modellnematoden Caenorhabditis elegans vergleichend untersucht. Dabei wurde eine starke Expression im Darm, eine moderate Expression in der Epidermis bzw. im Hautmuskelschlauch (in P. univalens) und eine niedrige Expression in den Gonaden in beiden Spezies festgestellt. Anhand eines neuen Transkriptomdatensatzes, welche durch die Inkubation adulter Würmer mit Ivermectin (IVM, ein gebräuchliches ML aus der Gruppe der Avermectine) oder einer Kontrolle generiert wurde, konnte keine Induzierbarkeit der Expression einzelner Pgps festgestellt werden. In den zwei zuvor genannten und unabhängig generierten Transkriptomdatensätzen taten sich PunPgp-9 und PunPgp-11.1 als die am stärksten exprimierten Pgps hervor, sowie in einem geringeren Ausmaß zwei PunPgp-16 Paraloge. Diese Ergebnisse bilden eine Basis für zukünftige Studien und erlauben eine gezielte Auswahl von Pgps für weitere Analysen.

Um das Substratspektrum und die Funktion nematodischer Pgps näher zu untersuchen, wurden P. univalens Pgps in verschiedenen Modellorganismen heterolog exprimiert. Zwei phylogenetisch entfernte P. univalens Pgps, PunPgp-2 und PunPgp-9, wurde durch die heterologe Expression in einem Saccharomyces cerevisiae Stamm mit ABC-TransporterDeletionen untersucht. Die Ergebnisse des bereits zuvor etablierten Hefewachstumsassay deuten darauf hin, dass IVM, jedoch nicht Thiabendazole (ein Antimykotikum und Anthelmintikum aus der Gruppe der Benzimidazole), als Substrat beider untersuchter Pgps konserviert ist.

Die im ersten Projektabschnitt und auch in anderen Studien beobachtete starke Expression im Darm und moderate Expression in der Epidermis führten zu der Hypothese, dass Pgps eine Rolle in der Barrierefunktion gegenüber MLs spielen. Da die Penetrationsroute der MLs in den Wurm nicht bekannt ist, wurde ebenfalls der Effekt aktiver oraler Ingestion durch die Stimulierung pharyngealen Pumpens (PP) untersucht.