Detecção Molecular de Sclerotinia Sclerotiorum (Lib.) de Bary, Agente Causal da Podridão Branca em Alface (Lactuca Sativa L.) Pela Reacção em Cadeia de Polimerase (Pcr)

Abstract

Neste trabalho estabeleceu-se um teste molecular, rápido e fácil, para detectar Sclerotinia sclerotiorum, responsável pela doença da podridão branca da alface, em folhas assintomáticas.

Desenharam-se primers específicos (SSM) para ampliar sequências parciais da região ITS de S. sclerotiorum, e utilizaram-se em reacções de PCR com alfaces infectadas. A análise das sequências obtidas indicou homologia significativa com sequências de S. sclerotiorum já conhecidas. Usaram-se os primers SSM com alfaces infectadas com Bremia lactucae e Botrytis cinerea verificando-se que apenas ampliavam fragmentos nas amostras com B. cinerea. A sequenciação destes fragmentos sugeriu a presença de sequências parciais de B. cinerea e também de Alternaria sp., além de S. sclerotiorum. Os fragmentos de S. sclerotiorum e Alternaria sp., com tamanho semelhante, poderão distinguir-se pela digestão dos produtos de PCR com RsaI. Alguns isolados de B. cinerea poderão ser discriminados com HindIII, mas não todos, já que outros apresentam sequências idênticas às identificadas em S. sclerotiorum. Estabeleceu-se uma reacção de PCR multiplex conjugando os primers SSM com os primers Br, específicos para ampliar sequências parciais da região ITS de B. lactucae, para detectar simultaneamente os patogénios referidos. A posterior digestão enzimática com RsaI e HindIII permite discriminar alguns daqueles patogénios

Alternate abstract:

This work established a molecular test, quick and easy to detect Sclerotinia sclerotiorum, responsible for white rot disease of lettuce, in asymptomatic leaves.

Specific primers (SSM) were designed to amplify partial sequences of ITS region of S. sclerotiorum, and were used in PCR reactions with infected lettuce. The analysis of the sequences obtained showed a significant homology with known sequences of S. sclerotiorum. These primers were also used with lettuce infected with Bremia lactucae and Botrytis cinerea, and only amplified fragments in B. cinerea samples. Resulting sequences suggested the presence of B. cinerea and also Alternaria sp., besides S. sclerotiorum. The fragments of S. sclerotiorum and Alternaria sp. with similar size may be discriminated through digestion of PCR products with RsaI. Some isolates of B. cinerea may be discriminated with HindIII digestion of the PCR product, but not all, as some B. cinerea isolates show in this region sequences identical to those identified in S. sclerotiorum.

A multiplex PCR reaction was settled combining SSM primers with primers Br, specific to amplify partial sequences of the ITS region of B. lactucae, to detect simultaneously those pathogens. The subsequent enzymatic digestion with RsaI and HindIII allows discrimination of some of those pathogens.