Insight into the Genetic Characteristics of Pneumococcal Isolates

Abstract

Streptococcus pneumoniae is a human pathogen and a major contributor to morbidity and mortality worldwide. It has been estimated that it is responsible for between 1-2million deaths annually. The normal niche for the pneumococci is the nasopharynx where the bacteria can reside for months without causing any symptoms. Different studies have shown that up to 70% of children attending day care centers may be carriers. S. pneumoniae can be divided into different serotypes based on differences in the capsular polysaccharide. Isolates of different serotypes have different ability to cause invasive disease, Invasive Disease Potential (IPD). Also the bacteria can be further divided into genetically related clones using methods such as pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and multi locus sequence typing (MLST). When using MLST parts of seven housekeeping genes are sequenced, and isolates belong to the same sequence type (ST) if they have identical sequences.

The overall aim of this work was to genetically characterize clinical pneumococcal isolates and to correlate their genetics to fitness, invasiveness and ability to spread. Clinical isolates with known origin were characterized using MLST and microarray. In addition growth rates, as a measurement for fitness, were determined for some isolates. Also mutants with deletions in specific genes or region of genes were created and compared to wild type TIGR4 in an intranasal murine model of infection.

We established that isolates of the same or related ST have similar genetic content. We also observed a trend that isolates belonging to serotypes associated with a high IDP have fewer genetic differences than isolates associated with lower IDP. We found the accessory genome of S. pneumoniae to be about 34% of the combined genomes of R6 and TIGR4, which were used as reference isolates. We determined that a large part of the accessory genome is located to smaller gene clusters around the genome, termed accessory regions (ARs). In addition to previously recognized regions we identified 5 new ARs giving a total of 41. We also found that by determining the presence or absence of a set of 25 accessory genes it was possible to determine the genetic relationship among the isolates. Furthermore, we found that virulence associated genes (found in signature tagged mutagenesis screens) may be absent in invasive human isolates. We tried to correlate the presence of different ARs with the IDP of the isolates. Two regions, AR6 and AR32, were found to be present in a higher proportion among isolates having a high IDP than those associated with a low IDP. However none of these regions were essential for mouse virulence in a serotype 4 background. We believe that the capacity to cause invasive disease is due to a combination of different regions, including the capsule, and that there is a redundancy amongst them. We did not find any gene or set of genes that correlated to the fitness of the bacteria. We did however observe that fitness in vitro is highly correlated to virulence in vivo. This was true for clinical isolates as well as constructed mutants.

Alternate abstract:

Streptococcus pneumoniae, även kallade pneumokocker, är en bakterie som kan ge upphov till flera olika sjukdomar i människan. Pneumokocker orsakar både lindrigare sjukdomar som öroninflammation och bihåleinflammation, men även allvarligare sjukdomar som lunginflammation, blodförgiftning och hjärnhinneinflammation. Uppskattningsvis orsakar pneumokocker årligen mellan 1-2 miljoner dödsfall runt om i världen. Pneumokocker kan även påvisas i näsa/svalg hos friska barn. Man har visat att upp till 70 % av barn som går på dagis kan vara koloniserade med bakterien och att bakterien kan finnas kvar i flera månader innan den försvinner.

Pneumokocker omges av en kapsel och kan beroende på skillnader i dessa kapslar delas in i grupper (serotyper). Man kan också, med hjälp av en metod som kallas MLST, dela in pneumokocker i grupper (kloner) baserat på likheter i deras gener. Det är inte känt varför vissa pneumokocker orsakar allvarlig sjukdom medan andra inte gör det, men man vet att kapseltypen har betydelse. Pneumokocker behandlas framförallt med penicillin, men förekomsten av bakterier med nedsatt känslighet (resistenta) blir allt vanligare.

Syftet med denna studie var att titta på det specifika geninnehållet i ett antal bakterieisolat som kommer från patienter respektive friska barn (s.k. kliniska isolat). Genom att jämföra bakterier, som kommer från patienter med blodförgiftning, med sådana som enbart burits av friska barn var förhoppningen att hitta gener som har betydelse för att bakterien ska ge upphov till allvarlig sjukdom. Vi ville också kartlägga varför en del genetiskt lika pneumockockgrupper (kloner) sprids så framgångsrikt i samhället.

Genom denna studie har vi kunnat påvisa att pneumokocker är genetiskt väldigt olika, endast ca 70 % av pneumokockgenerna finns i alla pneumokocker (att jämföra med över 99 % för människan). Resterande gener finns i en del isolat men saknas i andra, många av dessa gener ligger tillsammans i regioner i genomet (arvsmassan). Två av dessa regioner var vanligare i isolat som har kapacitet att orsaka allvarlig sjukdom än i andra isolat. För att vidare studera effekten av dessa två regioner konstruerades mutantstammar där respektive region har tagits bort. Dessa mutanter jämfördes sedan med de isolat som de konstruerats utifrån, i musförsök. Inga skillnader kunde dock påvisas. Även gener som i tidigare studier visats ha betydelse för hur virulenta (hur kapabla att orsaka sjukdom) bakterierna är saknades i flera av de isolat som undersöktes. Detta talar för att det inte finns bara en speciell region eller gen som har har betydelse för vilken sjukdomsgrad denna ger upphov till, utan att det är en kombination av flera. Det är också troligt att flera regioner med liknande funktion kan ersätta varandra och att man enbart skulle se skillnader om alla dessa togs bort samtidigt.

Vi kunde också demonstrera att man genom att använda metoden MLST (som enbart använder sig av karakterisering/sekvensering av sju konserverade gener och är en vanlig metod för att subtypa isolat i olika kloner) får fram resultat som är representativa för hela genomet. Stammar som funnits vara lika med hjälp av MLST skiljer sig bara på upp till 40 gener jämfört med ca 200 gener för stammar som skiljer sig med MLST.