Aspects of Sexual Reproduction in Mycosphaerella Species on Wheat and Barley: Genetic Studies on Specificity, Mapping, and Fungicide Resistance

Abstract

Mycosphaerella species are haploid ascomycetes that cause major economic losses in crops that include cereals, citrus fruits, and bananas, among others. Two organisms in this genus are Mycosphaerella graminicola (Fuckel) J. Schröt (anamorph Septoria tritici) and Septoria passerinii. M. graminicola is the causal agent of septoria tritici blotch of both bread wheat and durum wheat species, and S. passerinii causes septoria speckled leaf blotch of barley. M. graminicola is a heterothallic fungus with a very active sexual cycle, while no sexual cycle has been reported for S. passerinii.

This thesis includes studies on mating and genetics of both M. graminicola and S. passerinii. Chapter 1 gives an introduction to these pathogens and an overview of the research topics. In chapter 2, we studied the possibility of in planta generation of sexual progeny of the fungal wheat pathogen M. graminicola when one of the parents was avirulent on a resistant host. We found that avirulent isolates are able to survive and even increase in biomass after inoculation onto resistant wheat cultivars and can complete sexual cycles on resistant cultivars to yield viable ascospores as long as the other parent is virulent. To our knowledge, this is the first time such a phenomenon has been described, and the possibility to generate such crosses opened the door for studies in Chapters 3 and 4.

Chapter 3 describes the construction of two high-density genetic linkage maps of M. graminicola using Diversity Arrays Technology (DArT) and the integration of these into a core map with common markers due to a common parental isolate. One of the maps was constructed based on segregations of progeny of two bread wheat-derived isolates, IPO323 and IPO94269, and the other was constructed from segregations of progeny of IPO323 and the durum wheat-derived isolate IPO95052. In total, 1,144 markers made up the integrated core map. Analyses from this study revealed that progeny had translocations, diploid and partial diploid linkage groups, and loss of entire linkage groups.

Although M. graminicola causes disease on both bread wheat and durum wheat, isolates within the population show clear distinctions in either virulence on bread wheat or on durum wheat (host specificity). In Chapter 4, we studied the genetic basis of host specificity in M. graminicola using 163 progeny from crosses between the Dutch bread wheat-derived IPO323 and the Algerian durum wheat-derived IPO95052. Phenotyping of progeny was performed on a set of seven differential cultivars, and progeny crossed on either bread wheat or durum wheat could infect cultivars of bread wheat, durum wheat, both, or neither. These results were used to map nine quantitative trait loci (QTLs) on seven linkage groups in the high-density genetic linkage map from Chapter 3. One of these loci was previously mapped for cultivar specificity of IPO323in bread wheat, and the same locus was now mapped for host specificity of IPO323 to durum wheat. Our results show that the reported host specificity is probably the result of combinations of a number of independently inherited avirulence factors.

In addition to avirulence genes, fungi can inherit other traits for survival. One such heritable trait is a point mutation in the mitochondrial genome that conveys resistance to strobilurin fungicides. Chapter 5 describes a study on the inheritance of strobilurin resistance. Resistant and sensitive isolates of M. graminicola were crossed on wheat seedlings that were both untreated and preventively treated with various concentrations of azoxystrobin (Amistar™), and progeny were analyzed to determine the rate of inheritance of the aforementioned mutation. Preventive rates from 3.125-200% Amistar™ resulted in completely resistant progeny populations despite the fact that the segregation of nuclear genes confirmed regular meiotic behavior. We conclude that sensitive isolates overcome the disruption of mitochondrial respiration and participate in sexual reproduction even under high fungicide pressure and that fungicide stress induces or results in preferential mating in M. graminicola.

The barley pathogen S. passerinii clusters closely to M. graminicola in phylogenetic studies based on ITS sequences, and a high degree of genetic variation among isolates is found in nature. However, no teleomorph has been reported for this S. passerinii, and hence, it was considered to be asexual. Nevertheless, mating type idiomorphs were recently detected and isolated. In Chapter 6, we studied the possibility of a Mycosphaerella teleomorph associated with S. passerinii. Isolates with opposite mating types were coinoculated onto barley cultivars, and leaves were monitored for the discharge of ascospores. Characterization of a segregating population by both molecular and phenotypic analyses confirmed that we successfully generated the hitherto unknown Mycosphaerella teleomorph of S. passerinii.

Finally, the results of this thesis are discussed in a broader perspective in Chapter 7 in relation to epidemiology, co-evolution, and durability of resistance in the wheat-M. graminicola pathosystem. The proven ability of avirulent isolates of M. graminicola to generate sexual progeny on resistant cultivars represents a new dynamic in population genetics that has not previously been considered in epidemiology. Results from this thesis emphasize the complex ways in which the sexual cycle contributes to the overall success of M. graminicola on wheat.

Alternate abstract:

Mycosphaerella soorten zijn haploïde ascomyceten die zeer grote opbrengstverliezen veroorzaken in onder andere granen, citrusvruchten en bananenplanten. Twee soorten binnen dit geslacht zijn Mycosphaerella graminicola (Fuckel) J. Schröt (anamorph Septoria tritici) en Septoria passerinii. M. graminicola is de veroorzaker van septoria bladvlekkenziekte van brood- en durumtarwe, en S. passerinii veroorzaakt bladvlekkenziekte in gerst. M. graminicola is een heterothallische schimmel met een zeer actieve seksuele cyclus, terwijl voor S. passerinii tot nu toe geen geslachtelijke cyclus is beschreven.

Dit proefschrift beschrijft onderzoek naar de geslachtelijke voortplanting en de genetica van M. graminicola and S. passerinii. Hoofdstuk 1 is een introductie tot deze pathogenen en geeft een overzicht van de onderzoeksonderwerpen. In Hoofdstuk 2 wordt de in planta ontwikkeling van geslachtelijke nakomelingen van de pathogene tarweschimmel M. graminicola beschreven terwijl één van de ouders avirulent is. Wij hebben vastgesteld dat avirulente isolaten kunnen overleven en zelfs in biomassa toenemen na inoculatie van resistente tarweplanten en bovendien aan een geslachtelijke cyclus kunnen deelnemen en die voltooien tot en met de productie van kiemkrachtige ascosporen zolang de andere ouder in de geslachtelijke cyclus een virulent isolaat betreft. Naar ons beste weten is dit de eerste keer dat dit fenomeen is beschreven en dit resultaat bood de mogelijkheid tot het in Hoofdstuk 3 en 4 beschreven onderzoek.

Hoofdstuk 3 beschrijft de constructie van twee hoge-dichtheids genetische koppelingskaarten waarbij gebruik is gemaakt van Diversity Arrays Technology (DArT). De integratie van deze kaarten tot een brugkaart was mogelijk door gebruik te maken van een gezamenlijke ouder in beide kruisingen. Eén kaart werd gemaakt door de uitsplitsing van merkers in de nakomelingschap van een kruising tussen twee broodtarwe-isolaten, IPO323 en IPO94269, te bestuderen. De andere kaart is gebaseerd op de uitsplitsing van merkers in een populatie die werd verkregen uit een kruising tussen IPO323 en het durumtarwe-isolaat IPO95052. In totaal werden 1.144 merkers op de geïntegreerde kaart geplaatst. Analyse van deze kaarten liet zien dat translocaties en aneuploïdie regelmatig voorkwamen in de nakomelingschappen.

Hoewel M. graminicola in zowel brood- als durumtarwe septoria bladvlekkenziekte veroorzaakt, vertonen isolaten in natuurlijke populaties een duidelijke specificiteit voor deze soorten (waardplantspecificiteit). In Hoofdstuk 4 is de genetische basis voor deze waardplantspecificiteit in M. graminicola onderzocht in de nakomelingschappen (N=163) van de kruisingen tussen het Nederlandse broodtarwe-isolaat IPO323 en het Algerijnse durumtarwe-isolaat IPO95052. De fenotypering, van zowel op broodtarwe als op durumtarwe verkregen nakomelingen, werd uitgevoerd op zeven differentiërende tarwerassen waaruit bleek dat deze isolaten pathogeen waren op individuele brood- en/of durumtarwe rassen, maar dat er ook isolaten zijn die geen van de getoetste rassen kunnen aantasten. Deze resultaten zijn gebruikt om negen quantitative trait loci (QTLs) op zeven koppelingsgroepen van de in Hoofdstuk 3 beschreven hoge-dichtheids genetische koppelingskaart te plaatsen. Eén van deze loci werd eerder geplaatst als een broodtarwe cultivar-specifiek locus in IPO323 en blijkt nu ook verantwoordelijk te zijn voor de waardplantspecificiteit van dit isolaat voor de getoetste durumtarwe rassen. Onze gegevens laten zien dat waardplantspecificiteit mogelijk het resultaat is van de combinatie van een aantal onafhankelijk overerfbare avirulentiefactoren.

Naast avirulentiefactoren kunnen schimmels ook andere eigenschappen overdragen naar nakomelingen. Een dergelijke eigenschap is een door een puntmutatie in het mitochondrium veroorzaakte resistentie tegen strobilurine fungiciden. Hoofstuk 5 beschrijft een onderzoek naar de overerving van strobilurine resistentie. Resistente en gevoelige M. graminicola isolaten werden gekruist op onbehandelde en met diverse concentraties azoxystrobine (Amistar™) behandelde tarwe zaailingen. De nakomelingschappen werden geanalyseerd op de overerving van de hiervoor genoemde mutatie. Preventieve behandelingen met 3.125-200% Amistar™ resulteerde in volledig resistente nakomelingschappen ondanks het feit dat door nucleair gecodeerde eigenschappen normaal uitsplitsen en daarmee regelmatig meiotisch gedrag bevestigden. Wij concluderen dat gevoelige isolaten de uitschakeling van de mitochondriale ademhaling omzeilen door deel te nemen aan de geslachtelijke reproductie; zélfs onder hoge selectiedruk die dit gedrag in M. graminicola induceert of waaruit dit gedrag resulteert.

Uit fylogenetisch onderzoek, waarin gebruik is gemaakt van ITS sequenties, blijkt dat het gerstepathogeen S. passerinii nauw verwant is aan M. graminicola en dat natuurlijke populaties een grote genetische diversiteit vertonen. Echter, tot nu toe is er geen teleomorf voor deze schimmel gevonden en wordt zij daarom als ongeslachtelijk beschouwd. Desalniettemin zijn recent wel de paringsgenen geïdentificeerd en gekloneerd. In Hoofdstuk 6 is nagegaan of S. passerinii een Mycosphaerella teleomorf zou kunnen hebben. Isolaten met een tegengesteld paringstype werden gezamenlijk geïnoculeerd op gerstrassen en de bladeren werden onderzocht op het uitschieten van ascosporen. De karakterisering van een moeizaam verkregen uitsplitsende populatie met behulp van moleculaire en fenotypische kenmerken bevestigde uiteindelijk de productie van een tot nu toe onbekende Mycosphaerella teleomorf van S. passerinii.

Tenslotte worden de in dit proefschrift beschreven resultaten in Hoofdstuk 7 in een breder kader geplaatst en worden de implicaties voor de epidemiologie, co-evolutie en duurzaamheid van resistentie in het tarwe-M. graminicola pathosysteem besproken. Het feit dat avirulente M. graminicola isolaten een geslachtelijke cyclus kunnen aangaan op resistente rassen geeft een nieuwe invalshoek op de populatiegenetica van dit pathogeen die tot nu toe ook niet in overweging is genomen in de epidemiologie. De resultaten van dit proefschrift benadrukken de belangrijke rol van de geslachtelijke voortplanting voor het succes van M. graminicola als pathogeen van tarwe.