Phosphorylation and Proteome Dynamics in Pathogen-Resistant Tomato Plants

Abstract

Microbial plant pathogens impose a continuous threat on global food production. Similar to disease resistance in mammals, an innate immune system allows plants to recognise pathogens and swiftly activate defence. For the work described in this thesis, the interaction between tomato and the extracellular fungal pathogen Cladosporium fulvum serves as a model system to study host resistance and susceptibility in plant-pathogen interactions. Resistance to C. fulvum in tomato plants follows the gene-for-gene hypothesis, which requires the presence of a Cf resistance gene in tomato and presence of the cognate avirulence gene {Avr) in C. fulvum . Upon perception of the Avr by a tomato plant, a typical hypersensitive response (HR) is induced that renders the plant resistant to C. fulvum . In the years preceding this thesis work, most research was focussed on understanding which Avrs are produced by C. fulvum and how these Avrs are actually perceived by resistant plants (Chapter 1). The goal of the work described in this thesis is to reveal downstream signalling cascades triggered upon Avr perception. Therefore, the HR was studied by using a model system in which the Cf-4 protein of tomato and the Avr4 protein from C. fulvum were simultaneously expressed in tomato seedlings. Since the Cf-4/Avr-induced responses are inhibited at 33°C and high humidity, these Cf-4/Avr4 seedlings initiate a synchronized and reproducible HR after incubation at 33°C and a subsequent shift to 20°C, which allows studying downstream responses.

To prevent pathogen proliferation in the resistant plant, defence signalling cascades need to be activated extremely fast upon pathogen recognition. Therefore, many downstream signalling cascades depend on post-translational modifications (PTMs) that allow a rapid, reversible, controlled and highly specific transduction of perceived signals. An overview of the various types of PTMs and their role in the resistance response of plants to pathogens is provided in Chapter 2. In addition, examples are provided of successful pathogens that manipulate PTMs.

Protein phosphorylation seems to play an important role in the Cf-4/Avr4-triggered HR, since Avr4 perception leads to the specific activation of at least three mitogen-activated protein kinases, LeMPKl, -2 and -3, which requires phosphorylation by an upstream kinase (Chapter 3). Each of these three kinases seems to have a different role in downstream defence signalling, since the kinases were shown to have different phosphorylation specificities and therefore most likely have different downstream target substrates. Furthermore, these kinases appear to play a different role with regard to HR and full resistance to C. fulvum in tomato (Chapter 3 ).

Since protein phosphorylation was shown to play an important role in Cf-4/Avr4- induced defence signalling, the phosphoproteome of Cf-4/Avr4 and control seedlings after HR initiation was studied using a new approach (Chapter 4 ). This approach led to the identification of 50 phosphoproteins, most of which have not been described in tomato before. Quantification revealed 13 phosphoproteins with an altered abundance in the Cf-4/Avr4 seedlings as compared to the control, which implies HR-induced differential phosphorylation of these proteins. Phosphorylation-mediated regulation of the activity of these proteins pointed to a swift decrease in photosynthetic activity upon HR-initiation, which was confirmed by experiments in which the actual efficiency of the photosynthesis in the Cf4/Avr4 seedlings was determined upon induction of the HR. Furthermore, a shift from aerobic to anaerobic respiration, which possibly results from oxygen depletion caused by a massive oxidative burst consuming large amounts of oxygen, seems to take place upon initiation of the HR. Finally, differential phosphorylation of the four cytoplasmic isoforms of the Hsp90 chaperone protein was observed, suggesting that they play distinct roles during defence signalling (Chapter 4 ).

In addition to the HR, other associated defence responses are initiated upon recognition of C. fulvum . One of these responses is the secretion of defence-related proteins into the apoplast, which is the environment where C. fulvum operates. Therefore, the dynamics of the apoplastic proteome of resistant, (expressing plants and susceptible tomato plants lacking Cf-4, were studied after inoculation with a strain of C. fulvum that secretes Avr4 (Chapter 5). Analysis of the apoplastic proteome revealed a slow accumulation of defence proteins in the apoplast of susceptible plants, which is most likely the result of perception of general elicitors of C. fulvum by tomato. In resistant plants, the same set of proteins accumulates in the apoplast, but this occurs much faster and to higher levels. The accelerated response is caused by the Cf-4/Avr4-initiated HR that also leads to cell death. The HR, in combination with the accelerated protein secretion, renders the plants resistant to C. fulvum . In addition, in susceptible plants C. fulvum seems to specifically downregulate genes encoding cell wall proteins of which the accumulation possibly hampers nutrient and water uptake and thereby proliferation of the pathogen in the tomato apoplast. Possibly, an effector of C. fulvum targets a receptor for general elicitors, thereby suppressing transcription of these genes (Chapter 5 ).

Most data described in this thesis have been obtained from Cf-4/Avr4 seedlings in which the HR can be inhibited by incubating the plants at 33°C. The present data suggest that this temperature-sensitivity occurs at the site of signal perception. Possibly, cytoplasmic Hsp90 stabilizes R protein complexes localized at the plasma membrane. Upon high temperature stress, an increased demand for Hsp90 occurs in the cells to stabilize unfolding proteins that play a role in basal cellular processes, which could lead to the release and subsequent degradation of R protein complexes, rendering defence signalling temperature-sensitive (Chapter 6 ). The temperature-sensitivity of the Cf-4/Avr4-initiated HR provides a very clean and reproducible tool to study the HR, in the absence of the fungus that produces the Avr. Furthermore, the data described in this thesis provide evidence that the Cf4/Avr4 seedlings recover from the temperature stress before the specific Cf-4/Avr4-triggered HR is initiated. The possibility to separate the events directly associated with the HR from the full resistance response of the plant to the invading fungus, provides new insight into the complexity of plant defence responses and their specific suppression upon successful colonization by C. fulvum (Chapter 6 ). Comparison of the defence response to other processes that occur in the cell underlines that resistance and HR execution cannot be seen as an independent and separate process in resistant plants that have recognized a pathogen. On the contrary, signalling cascades seem to depend on similar components and on cascades that possibly converge, eventually leading to a similar response (Chapter 6 ). Finally, an up to date model for the Cf-4/Avr4-triggered HR and resistance is proposed, based on data that have been published before and the results obtained with the research described in this thesis (Chapter 6 ).

Alternate abstract:

Pathogene micro-organismen kunnen plantenziekten veroorzaken en vormen een constante bedreiging voor de wereld voedselproductie. Net als bij zoogdieren en mensen hebben planten een afweersysteem dat micro-organismen als 'lichaamsvreemd' herkent waardoor een afweerreactie wordt geactiveerd. In dit proefschrift wordt de afweerreactie van tomaat tegen de pathogene schimmel Cladosporium fulvum bestudeerd. De interactie tussen deze extracellulaire ziekteverwekker en tomaat volgt de gen-om-gen hypothese en wordt gebruikt als een modelsysteem om resistentie en vatbaarheid van planten tegen pathogenen te bestuderen. Wanneer C. fulvum bladeren van de tomatenplant binnendringt door openstaande huidmondjes, worden diverse kleine eiwitten uitgescheiden door de schimmel die een rol spelen bij het infectieproces. Tussen deze eiwitten bevinden zich ook de zogenaamde avirulentie eiwitten (Avrs), welke gecodeerd worden door Avr genen. Een tomatenplant met een Cf resistentiegen kan een specifieke Avr herkennen, wat vervolgens leidt tot een overgevoeligheidsreactie. Deze reactie heeft lokale celdood tot gevolg wat de plant resistent maakt tegen C. fulvum . In de jaren voorafgaand aan het beschreven onderzoek is vooral bestudeerd welke Avrs C. fulvum maakt en hoe deze Avrs herkend worden door de plant (Hoofdstuk 1). Het doel van het hier beschreven onderzoek is het ontrafelen van de signalering die plaatsvindt in de tomatenplant na herkenning van een Avr, en hoe dit uiteindelijk leidt tot resistentie. Daarvoor is gebruik gemaakt van transgene tomatenzaailingen die zowel Cf-4 van tomaat als Avr4 van C. fulvum tot expressie brengen, wat leidt tot een overgevoeligheidsreactie in de plant. Deze reactie kan echter onderdrukt worden door de planten bij 33°C en hoge luchtvochtigheid te plaatsen, waarna een gesynchroniseerde en gecontroleerde overgevoeligheidsreactie kan worden gei'nduceerd door de zaailingen naar 20°C terug te brengen. Deze Cf-4/Avr4 zaailingen vormen een zeer geschikt systeem om de signalering van planten in relatie tot ziekteresistentie te ontrafelen.

Signalering die leidt tot het activeren van een afweerreactie na herkenning van een pathogeen moet snel zijn om de ziekteverwekker geen kans te geven. De (de)activering van eiwitten betrokken bij signalering is vaak gebaseerd op post-translationele modificaties (PTMs) die zorgen voor een snelle, gecontroleerde, omkeerbare en zeer specifieke verandering van de activiteit van het eiwit. Daarom wordt in Hoofdstuk 2 een literatuuroverzicht gegeven van allerlei typen PTMs en de rol die deze PTMs spelen in de resistentiereactie van planten. Bovendien worden voorbeelden gegeven van de manipulatie van deze PTMs door succesvolle ziekteverwekkers.

Eiwitfosforylatie lijkt een belangrijke rol te spelen bij de signalering geinduceerd door Avr4 herkenning in resistente Cf-4 tomatenplanten, aangezien tijdens de afweerrespons in Cf4/Avr4 zaailingen minstens drie mitogen-geactiveerde kinases, LeMPKl, -2 en -3, worden geactiveerd door fosforylatie (Hoofdstuk 3). Deze geactiveerde kinases fosforyleren vervolgens zelf ook eiwitten, waarmee de signalering wordt voorgezet. LeMPKl, -2 en -3 blijken een verschillende fosforylatiespecificiteit te hebben en spelen een verschillende rol in de overgevoeligheidsreactie en resistentie tegen C. fulvum . Daarom is het waarschijnlijk dat deze kinases elk een verschillende rol hebben in de afweersignalering (Hoofdstuk 3).

Aangezien fosforylatie een belangrijke rol speelt in de afweersignalering die geactiveerd wordt in de Cf-4/Avr4 zaailingen, wordt er in Hoofdstuk 4 een nieuwe analyse beschreven waarin gefosforyleerde peptiden van Cf-4/Avr4 en controle zaailingen werden gelsoleerd. Deze analyse heeft geleid tot de identificatie van 50 gefosforyleerde eiwitten waarvan de meerderheid niet eerder werd beschreven voor tomatenplanten. Vergeleken met de controles waren 13 gefosforyleerde eiwitten in significant hogere of juist lagere hoeveelheden aanwezig in de Cf-4/Avr4 zaailingen, wat differentiele fosforylatie van deze eiwitten suggereert. Regulatie van de activiteit van deze eiwitten door fosforylatie suggereerde bijvoorbeeld dat er een snelle afname van de fotosyntheseactiviteit plaatsvindt als gevolg van het initieren van de overgevoeligheidsreactie. Deze waarneming is bevestigd door metingen die laten zien dat de fotosyntheseactiviteit inderdaad zeer snel en specifiek afneemt in de Cf-4/Avr4 zaailingen. Daarnaast wijzen de data er ook op dat de plant overgaat van aerobe naar anaerobe respiratie wanneer de overgevoeligheidsreactie wordt gei'nitieerd. Dit komt waarschijnlijk door de sterke oxidatieve readies die tijdens deze respons plaatsvinden, welke leiden tot een gebrek aan zuurstof. Ten slotte wijzen de bevindingen ook op een differentiele rol voor de vier verschillende isovormen van cytoplasmatisch Hsp90 in de overgevoeligheidsreactie, aangezien de isovormen verschillend worden gefosforyleerd op hetzelfde geconserveerde fosforylatiemotief tijdens het activeren van de afweerrespons (Hoofdstuk 4).

Naast de overgevoeligheidsreactie worden er ook andere reacties gei'nduceerd in tomatenplanten die C. fulvum herkennen, zoals het uitscheiden van afweergerelateerde eiwitten in de extracellulaire ruimtes van het tomatenblad; de omgeving waar C. fulvum zich ophoudt. Om de dynamiek van deze uitscheiding van extracellulaire eiwitten te bestuderen, zijn tomatenplanten met en zonder het Cf-4 resistentiegen gei'noculeerd met een fyfulvum dat Avr4 produceert (Hoofdstuk 5). In vatbare planten, die Avr4 niet herkennen, accumuleren diverse extracellulaire eiwitten langzaam als gevolg van herkenning van algemene iichaamsvreemde' componenten afkomstig van C. fulvum . In resistente planten accumuleert dezelfde set eiwitten veel sneller en in veel grotere hoeveelheden, wat veroorzaakt wordt door de Cf-4/Avr4-gei'nduceerde overgevoeligheidsreactie. De combinatie van de overgevoeligheidsreactie en het snelle uitscheiden van deze extracellulaire eiwitten leidt tot resistentie tegen C. fulvum . Verder lijkt C. fulvum actief de expressie van een set van genen te onderdrukken die coderen voor eiwitten die ophopen in de celwand. Accumulatie van deze eiwitten bemoeilijkt mogelijk de opname van water en voedingsstoffen uit de eel en daarmee de kolonisatie en sporulatie van C. fulvum (Hoofdstuk 5).

De resultaten beschreven in dit proefschrift zijn verkregen door Cf-4/Avr4 zaailingen te gebruiken waarin de overgevoeligheidsreactie kan worden onderdrukt bij 33°C. Eerdere resultaten suggereren dat de Cf-4/Avr4-geactiveerde afweerrespons temperatuurgevoelig is doordat de herkenning van Avr4 wordt geblokkeerd. Hsp90 is een eiwit dat andere eiwitten stabiliseert en dat mogelijk ook Cf-4 stabilised! Bij hoge temperaturen stabiliseert Hsp90 eiwitten die door de hoge temperatuur dreigen te ontvouwen en die nodig zijn voor basale celfuncties, waardoor de vraag naar Hsp90 toeneemt. Dit zou kunnen leiden tot destabilisatie en afbraak van Cf-4, waardoor de Avr4 herkenning temperatuurgevoelig wordt (Hoofdstuk 6). Doordat de overgevoeligheidsreactie in de Cf-4/Avr4 zaailingen temperatuurgevoelig is, zijn deze planten geschikt om synchroon en reproduceerbaar de overgevoeligheidsreactie te induceren zonder dat de aanwezigheid van de schimmel nodig is. De mogelijkheid om de Cf4/Avr4-geTnduceerde overgevoeligheidsreactie te bestuderen, onafhankelijk van de totale set aan afweerresponsen van Cf-4 tomaat gei'noculeerd met een Avr-producerend fysio van C. fulvum , geeft nieuwe inzichten in de complexiteit van de plant afweerreacties en de onderdrukking van deze response door de schimmel in vatbare planten (Hoofdstuk 6). Een vergelijking van afweerreacties en andere processen die plaatsvinden in plantencellen laat zien dat de aan resistentie gerelateerde responsen niet als onafhankelijke processen in de eel gezien kunnen worden. Veel eiwitten die een rol spelen in afweerreacties zijn namelijk ook betrokken bij processen als ontwikkeling, veroudering en onderhoud van de eel (Hoofdstuk 6). Ten slotte wordt er in dit hoofdstuk een geintegreerd overzicht gegeven van de Cf-4/Avr4- gei'nduceerde overgevoeligheidsreactie en resistentie, gebaseerd op eerder verkregen resultaten en de resultaten beschreven in dit proefschrift.