Investigating the Role of Mineralization of Bioactive Glass in Wound Healing Using a Cellular 3D Collagen Matrix

Abstract

Background: Chronic wounds suffer from low blood supply to the wound bed, a condition usually marked by low vascular endothelial growth factor (Vegf) levels and subsequently less angiogenesis. While originally designed to repair mineralized tissues, bioactive glasses have recently gained much interest as a treatment to accelerate the healing in chronic wounds. The main argument supporting their use is based on their ionic stimuli by enhancing particular processes, such as angiogenesis, and aiding in the healing stages of inflammation, proliferation, and maturation. However, the majority of in-vitro cell culture research remains based on twodimensional and ionic release-only models, with little research done on three-dimensional direct contact models; especially with regard to wound healing, bioactive glass and the potential of ectopic mineralization. Methods: In this work, a three-dimensional model was developed to study the function of NIH/3T3 fibroblasts when in direct contact with a classical bioactive glass; 45S5 Bioglass^®, when amorphous, post pre-conditioning in simulated body fluid (SBF) for 3 and 14 days to induce different extents of mineralization and synthetic hydroxyapatite (HAp). Cells were cultured in dense collagen gels of approximately 13.4 wt%, either alone or when incorporated with amorphous 45S5 Bioglass^®, 3- and 14-day conditioned 45S5 Bioglass^® or HAp particles for up to 23 days, in-vitro. The proliferation, metabolic activity, viability, matrix mineralization and the expression of genes implicated in would healing, namely Vegf, alpha-smooth muscle actin (α-SMA), transforming growth factor beta (Tgfb1), and collagen (Col1a1), were investigated along with bone sialoprotein (Ibsp) as an indicator of cell-mediated matrix mineralization. Results: The 45S5 Bioglass^® particle specific surface area increased 900-fold after 14 days of conditioning in SBF. Scanning electron microscopy (SEM), X-ray diffraction and attenuated total reflectance- Fourier-transform infrared spectroscopy analyses confirmed the partial mineralization of the amorphous 45S5 Bioglass ^® through the formation of a surface hydroxycarbonate apatite layer. Inductively coupled plasma-optical emission spectrometry analysis indicated amorphous 45S5 Bioglass^® had the highest release level of alkaline species in deionized water. Its incorporation into fibroblast-seeded dense collagen gels led a decrease in initial cell proliferation, metabolic activity, and viability. Cells in direct contact with partially mineralized 45S5 Bioglass^® and HAp had comparable metabolic activities and proliferation. Vegf expression levels were highest at day 2 for cells in contact with amorphous and 3-day mineralized 45S5. By day 23, Vegf expression significantly decreased in cells when in contact with amorphous 45S5, whereas those in the presence of 14-day mineralized 45S5 displayed the highest expression. HAp conditioning experienced the highest α-SMA expression at day 2 in culture. Col1a1 expression levels significantly decreased for both 3-day mineralized glass and HAp. No significant differences were observed for Tgfb1 under all conditions. By day 23 in culture, 45S5 Bioglass^® incorporated dense collagen also underwent greater mineral deposition with its seeded NIH/3T3 cells experiencing highest induction in Ibsp expression. This mineralization effect and Ibsp expression decreased with an increase in pre-conditioning time of 45S5 Bioglass^® in SBF. Furthermore, upon prolonged culturing (up to 23 days), cells seeded in the dense collagen gels showed an upregulation of specific osteogenic markers; alkaline phosphatase (Alpl), Sp7 (encodes osteogenic transcription factor OSX), and runt-related transcription factor 2 (Runx2) along with the formation of osteoid-like structures as examined under SEM, and verified by von-Kossa-van Gieson staining. This illustrates the ability of NIH/3T3 cell lines to subscribe to an osteogenic pathway upon prolonged culturing in dense collagen gels and in the absence of osteogenic media. Conclusions: The direct contact of 45S5 Bioglass^® with fibroblasts in dense collagen gels appeared to reduce their initial proliferation, metabolic activity and delay their transition from an initially rounded to spindle shape morphology. Amorphous 45S5 Bioglass^® also induced Vegf initially, while in longer term, a significant degree of matrix mineralization through particle deposition and upregulation of bone markers. This mineralization potential seems to decrease with increase in pre-conditioning in SBF. These findings indicate the potential of ectopic mineralization as a result of 45S5 Bioglass^® incorporation. Furthermore, the induction of osteogenic differentiation of NIH/3T3 in a dense collagen environment, suggests for their ability to subscribe to the osteogenic pathway.

Alternate abstract:

Contexte : Les plaies chroniques souffrent d'un faible approvisionnement en sang au niveau du lit de la plaie, une condition généralement marquée par de faibles taux en facteur de croissance endothélial vasculaire (Vegf) et par la suite une moindre angiogenèse. Bien qu'initialement conçus pour réparer les tissus minéralisés, les verres bioactifs ont récemment sollicité beaucoup d'intérêt comme traitement pour accélérer la cicatrisation des plaies chroniques. L'argument principal soutenant leur utilisation repose sur leurs capacités de stimulations ioniques améliorant des procédés particuliers, tels que l'angiogenèse, et facilitant les phases de guérison de l'inflammation, prolifération et maturation. Toutefois, la majorité des recherches sur cultures cellulaires in vitro restent basées sur des modèles bidimensionnels et de libération ionique uniquement, alors que peu de recherches portent sur des modèles tridimensionnels à contact direct, notamment en ce qui concerne la cicatrisation des plaies, le verre bioactif et le potentiel de minéralisation ectopique. Méthodes : Dans cette étude, un modèle tridimensionnel a été développé pour étudier la fonction de fibroblastes NIH/3T3 lorsqu'ils sont en contact direct avec un verre bioactif classique ; 45S5 Bioglass^®, lorsqu'il est sous forme de particules amorphes et après préconditionnement dans un liquide physiologique simulé (SBF) pendant 3 à 14 jours pour induire des degrés différents de minéralisation. Les cellules ont été cultivées dans un gel de collagène dense d'environ 13,4 % en poids, seules ou incorporées avec des particules de 45S5 Bioglass^® amorphe, de 45S5 Bioglass^® conditionné 3 et 14 jours ou des particules d'hydroxyapatite synthétique (HAp) jusqu'à 23 jours, in vitro. La prolifération, l'activité métabolique, la viabilité, la minéralisation de la matrice et l'expression de gènes impliqués dans la cicatrisation des plaies, à savoir Vegf, l'actine alpha des muscles lisses (α-SMA), le facteur de croissance transformant bêta (Tgfb1) et le collagène (Col1a1), ont été analysés avec la sialoprotéine osseuse (Ibsp) comme indicateur de la minéralisation de la matrice à médiation cellulaire. Résultats : La surface spécifique des particules de 45S5 Bioglass^® a augmenté de 900 fois après 14 jours de conditionnement dans le SBF. Les analyses par microscopie électronique à balayage (SEM), diffraction des rayons X et spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) par réflectance totale atténuée (ATR) ont confirmé la minéralisation partielle du Bioglass^® 45S5 amorphe par la formation d'une couche d'hydroxycarbonate d'apatite de surface. L'analyse par spectrométrie d'émission optique à plasma à couplage inductif (ICP-OES) a indiqué que le Biograss^® 45S5 amorphe avait la libération d'espèces alcalines la plus élevée dans l'eau désionisée. Son incorporation dans les gels de collagène denses ensemencés en fibroblastes entraînait une diminution de la prolifération cellulaire initiale, de l'activité métabolique et de la viabilité. Les cellules en contact direct avec le Bioglass^® 45S5 partiellement minéralisé et l'HAp avaient des activités métaboliques et une prolifération comparables. Les niveaux d'expression de Vegf étaient les plus élevés au jour 2 pour les cellules en contact avec le 45S5 amorphe et pour celles en contact avec le 45S5 minéralisé pendant 3 jours. Au jour 23, l'expression de Vegf avait diminué significativement dans les cellules en contact avec le 45S5 amorphe, alors que celles maintenues en présence de 45S5 minéralisé pendant 14 jours présentaient la plus haute expression de Vegf. Les cellules conditionnées à l'HAp présentaient la plus haute expression d'α-SMA au jour 2 en culture. Les niveaux d'expression de Col1a1 diminuaient significativement pour le verre minéralisé 3 jours et l'HAp Aucune différence significative n'a été observée pour le Tgfb1 dans toutes les conditions expérimentales. Au jour 23 en culture, le collagène dense incorporé dans le 45S5 Biograss^® avait également subi une déposition minérale plus importante avec ses cellules NIH/3T3 ensemencées qui présentaient la plus forte induction d'expression d'Ibsp. Cet effet de minéralisation et d'expression de l'Ibsp diminuait avec l'augmentation du temps de préconditionnement du 45S5 Bioglass^® dans le SBF. En outre, lors de la mise en culture prolongée (jusqu'à 23 jours), les cellules ensemencées dans des gels de collagène dense ont montré une régulation à la hausse des marqueurs ostéogéniques spécifiques ; la phosphatase alkaline (Alpl), le facteur de transcription Sp7 et le facteur de transcription 2 lié au runt (RUNX2) en même temps que la formation de structures de type ostéoïde comme examiné sous SEM et vérifiée par coloration von Kossa-van Gieson. Ceci illustre la capacité des lignées cellulaires NIH/3T3 à souscrire à une voie ostéogénique lors d'une permanence prolongée en culture dans des gels de collagène denses et en l'absence de milieux ostéogéniques. Conclusions : Le contact direct de 45S5 Bioglass^® avec des fibroblastes dans des gels de collagène dense semble réduire leur prolifération initiale, l'activité métabolique et retarde la transition entre une morphologie initialement arrondie vers une morphologie fusiforme. Le 45S5 Bioglass^® amorphe induit également initialement le Vegf et, à plus long terme, un degré important de minéralisation de la matrice par dépôt de particules et la régulation à la hausse des marqueurs osseux. Ce potentiel de minéralisation semble diminuer avec l'augmentation de la durée de préconditionnement dans le SBF. Ces résultats indiquent le potentiel de minéralisation ectopique à la suite de l'incorporation de Biograss^® 45S5. En outre, l'induction de la différenciation ostéogénique des NIH/3T3 dans un environnement de collagène dense met en évidence leur capacité à emprunter la voie ostéogénique.