Séquence Atypique de la Mort des Neutrophiles Humains Exposés au Mercure

Abstract

Le mercure est reconnu pour ses actions neurotoxiques, mais il est capable d'induire aussi des effets immunotoxiques incluant des maladies auto-immunes et un état d'immunosuppression entraînant une incidence accrue des maladies infectieuses. Le but de cette étude était d'évaluer les effets du chlorure de méthylmercure (MeHgCl) sur la séquence des évènements au cours de 1' apoptose et de la nécrose des polymorphonucléaires (PMN) neutrophiles humains et d'identifier les mécanismes de cytotoxicité impliqués. Pour ce faire, les neutrophiles humains ont été mis en culture in vitro durant différentes périodes de temps (0 à 3 jours) en présence ou non de MeHgCl (10^-12-10^-3 M). Nous avons d'abord utilisé le double marquage à l'annexine-V-FITC et à l'iodure de propidium (Pl) suivi d'une analyse en cytométrie en flux pour évaluer l'apoptose et la nécrose. Par la suite, le marquage avec Hoechst 33342 et PI a été effectué afin de mieux distinguer entre les phases de nécrose primaire et de nécrose secondaire. Les altérations morphologiques typiques de l'apoptose ont été analysées par microscopie optique. Le calcium intracellulaire (Ca2+)i a été mesuré par cytométrie en flux à l'aide de la sonde spécifique Auo-3. L'implication du potentiel membranaire mitochondrial (.l\'Pm) a été étudiée également en cytométrie en flux à l'aide du marqueur sélectif JC-1 (5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide). Nos résultats démontrent qu'en présence de MeHgCl à des concentrations supérieures à w-s M, la majorité des neutrophiles vont rapidement en apoptose, en moins de 10⁵ minutes. Les neutrophiles progressent ensuite vers la nécrose primaire après 1-2 h d'incubation en présence de MeHgCl. Les cellules non traitées vont spontanément en apoptose à partir de 8 h d'incubation et elles se trouvent en majorité dans cette phase après 24 h. Cette apoptose spontanée est suivie de la nécrose secondaire qui apparaît après 24-96 h. Une exposition des neutrophiles à 56°C induit la nécrose primaire, mais pas l'apoptose. Ces résultats révèlent pour la première fois que le mercure induit une séquence de mort cellulaire atypique incluant d'abord l'apoptose, puis la nécrose primaire. De plus, le mercure induit des changements biochimiques précoces, incluant une augmentation du niveau de [Ca²⁺]i et une diminution du potentiel membranaire, suggérant l'implication de ces deux signaux intracellulaires dans la mort cellulaire induite par le mercure. Les conséquences de la séquence particulière de la mort des neutrophiles humains en présence de mercure ne sont pas connues en terme d'immunotoxicité. Cependant, nos résultats supportent l'idée que contrairement au concept traditionnel, les phénomènes de mort cellulaire par apoptose et par nécrose primaire ne représentent pas des entités diamétralement opposées, et qu'un même toxique peut induire d'abord l'apoptose puis la nécrose primaire.

Abstract (AI English translation)

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Mercury is recognized for its neurotoxic actions, but it is also capable of inducing immunotoxic effects including autoimmune diseases and a state of immunosuppression leading to an increased incidence of infectious diseases. The aim of this study was to evaluate the effects of methylmercury chloride (MeHgCl) on the sequence of events during apoptosis and necrosis of polymorphonuclear (PMN) human neutrophils and to identify the mechanisms of cytotoxicity involved. To do this, human neutrophils were cultured in vitro for different periods of time (0 to 3 days) in the presence or absence of MeHgCl (10^-12-10^-3 M). We first used annexin-V-FITC and propidium iodide (PI) double labeling followed by flow cytometry analysis to assess apoptosis and necrosis. Subsequently, staining with Hoechst 33342 and PI was carried out in order to better distinguish between the phases of primary necrosis and secondary necrosis. Morphological alterations typical of apoptosis were analyzed by optical microscopy. Intracellular calcium (Ca2+)i was measured by flow cytometry using the specific Auo-3 probe. The involvement of the mitochondrial membrane potential was also studied by flow cytometry using the selective marker JC-1 (5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide). Our results demonstrate that in the presence of MeHgCl at concentrations greater than w-s M, the majority of neutrophils rapidly go into apoptosis, in less than 105 minutes. Neutrophils then progress to primary necrosis after 1-2 h of incubation in the presence of MeHgCl. The untreated cells go spontaneously into apoptosis from 8 h of incubation and they are mostly in this phase after 24 h. This spontaneous apoptosis is followed by secondary necrosis which appears after 24-96 h. Exposure of neutrophils to 56°C induces primary necrosis, but not apoptosis. These results reveal for the first time that mercury induces an atypical cell death sequence including first apoptosis and then primary necrosis. Moreover, mercury induces early biochemical changes, including an increase in [Ca2+]i level and a decrease in membrane potential, suggesting the involvement of these two intracellular signals in mercury-induced cell death. The consequences of the particular sequence of death of human neutrophils in the presence of mercury are not known in terms of immunotoxicity. However, our results support the idea that contrary to the traditional concept, the phenomena of cell death by apoptosis and by primary necrosis do not represent diametrically opposed entities, and that the same toxicant can induce first apoptosis and then necrosis. primary.