Sélection et caractérisation d'une nouvelle chitosanase thermostable

Abstract

Le but de mon projet de doctorat est la recherche de chitosanases thermostables qui peuvent mener la réaction d'hydrolyse du chitosane à de hautes températures. La procédure mise au point pour isoler ces chitosanases était planifiée pour moduler l'effet antimicrobien du chitosane qui augmente avec son poids moléculaire. Les objectifs spécifiques de ce projet sont, mettre au point un nouveau dosage de Csn, purifier, caractériser et cloner le gène des chitosanases les plus thermostables sélectionnées et mettre au point un milieu de production de chitosanase.

La première étape du projet est la recherche de nouvelles chitosanases thermostables, via un criblage ciblé de bactéries productrices de chitosanases. En effet, une nouvelle méthode d'enrichissement était utilisée par l'ajout de chitosane de différents poids moléculaires à notre source bactérienne, soit les composts. La deuxième étape, est la réalisation d'un dosage de l'activité chitosanase en utilisant le soluble-dyed Remazol Brillant Bleu-Chitosane (sRBB-C) qui a été mise au point pour détecter à grande échelle une activité chitosanase de manière facile et rapide. Enfin, la troisième étape est un test de thermostabilité en présence de substrat, appliqué à des chitosanases choisies, pour sélectionner les plus performantes à l'étape de la purification. Parmi le lot de chitosanases testées, la chitosanase notée Csnl 794 s'est distinguée par sa thermostabilité à 70 °C, ainsi elle a été retenue pour des études plus approfondies. Les études biochimiques réalisées sur la Csnl 794 après purification ont révélé qu'elle a un poids moléculaire de 40 kDa, un pH optimal de 4.8 et des K_m et k_cat de 0.042 mg/ml et 7588 min^-1 respectivement. Le temps de demi-vie de la Csnl 794 en présence de chitosane est plus de 20 heures à 70 °C. L'activité de la Csnl 794 varie légèrement avec le degré d'acétylation du chitosane, elle hydrolyse la carboxyméthyl-cellulose, mais pas la chitine. Le clonage du gène de la Csnl 794 par génétique inverse a permis de déterminer sa séquence. Ce gène code pour une protéine de 441 acides aminés. La Csnl 794 appartient à la famille 8 des glycosides hydrolases (GH8).

Le rang taxonomique de l'isolat produisant la Csn1794 a été déterminé par des méthodes classiques ainsi que par des tests de biologie moléculaire. Les résultats obtenus indiquent qu'il s'agit d'un isolat appartenant à une espèce non caractérisée appartenant au genre Paenibacillus qu'on a appelé Paenibacillus sp. 1794.

Enfm, la méthode dé plan d'expériences était utilisée pour mettre au point le milieu de production de la Csnl 794. Les essais réalisés par les plans d'expériences Plackett- Burman ont permis non seulement de définir un milieu de base pour la production de la Csn1794, mais aussi les oligosaccharides et le sucrose se sont distingués comme facteurs à effet nettement positif sur la production de la Csnl 794. Les essais par plans d'expérience Box-Hunter ont permis l'étude d'interactions entre les différents facteurs dont le niveau était déterminé par les plans Taguchi. Les résultats obtenus indiquent qu'en plus de milieu de base, l'ajout de 10g/1 de glucosamine, 7g/1 d'oligosaccharide et 4g/1 de sucrose constitue la meilleure combinaison pour un milieu qui permet de produire une moyenne de 7U/ml de Csn1794 d'une manière constante.

En conclusion, nous disposons d'une nouvelle chitosanase thermostable, facile à produire et à purifier, qui sera un outil adéquat pour l'application au niveau industriel. Ceci va non seulement permettre de mener le processus d'hydrolyse de chitosane à haute température, mais aussi d'utiliser de grandes concentrations de substrat sans que la viscosité ne devienne excessive. Au niveau de la recherche fondamentale, la Csn1794 peut nous apporter plus d'informations d'une part, sur la thermostabilité des enzymes et d'autre part, sur les enzymes de la famille GH8, notamment les chitosanases. (Abstract shortened by UMI.)

Abstract (AI English translation)

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The aim of my doctoral project is the search for thermostable chitosanases which can carry out the chitosan hydrolysis reaction at high temperatures. The procedure developed to isolate these chitosanases was planned to modulate the antimicrobial effect of chitosan which increases with its molecular weight. The specific objectives of this project are to develop a new Csn assay, purify, characterize and clone the gene of the most heat-stable chitosanases selected and develop a chitosanase production medium.

The first step of the project is the search for new thermostable chitosanases, via targeted screening of chitosanase-producing bacteria. Indeed, a new enrichment method was used by adding chitosan of different molecular weights to our bacterial source, namely composts. The second step is the performance of an assay of chitosanase activity using the soluble-dyed Remazol Brillant Bleu-Chitosan (sRBB-C) which has been developed to detect chitosanase activity on a large scale in an easy and fast. Finally, the third step is a thermostability test in the presence of substrate, applied to selected chitosanases, to select the most efficient at the purification stage. Among the batch of chitosanases tested, the chitosanase noted Csnl 794 stood out for its thermostability at 70 °C, so it was retained for more in-depth studies. Biochemical studies carried out on Csnl 794 after purification revealed that it has a molecular weight of 40 kDa, an optimal pH of 4.8 and Km and kcat of 0.042 mg/ml and 7588 min-1 respectively. The half-life of Csnl 794 in the presence of chitosan is more than 20 hours at 70°C. The activity of Csnl 794 varies slightly with the degree of acetylation of chitosan; it hydrolyzes carboxymethyl cellulose, but not chitin. Cloning of the Csnl 794 gene by reverse genetics made it possible to determine its sequence. This gene codes for a protein of 441 amino acids. Csnl 794 belongs to the glycoside hydrolase family 8 (GH8).

The taxonomic rank of the Csn1794-producing isolate was determined by classical methods as well as molecular biology tests. The results obtained indicate that it is an isolate belonging to an uncharacterized species belonging to the genus Paenibacillus which was called Paenibacillus sp. 1794.

Finally, the design of experiments method was used to develop the production medium for Csnl 794. The tests carried out by the Plackett-Burman design of experiments made it possible not only to define a basic medium for the production of Csn1794, but also oligosaccharides and sucrose stood out as factors with a clearly positive effect on the production of Csnl 794. The Box-Hunter experimental design tests allowed the study of interactions between the different factors including the level was determined by the Taguchi plans. The results obtained indicate that in addition to the basic medium, the addition of 10g/1 of glucosamine, 7g/1 of oligosaccharide and 4g/1 of sucrose constitutes the best combination for a medium which makes it possible to produce an average of 7U /ml of Csn1794 in a constant manner.

In conclusion, we have a new thermostable chitosanase, easy to produce and purify, which will be a suitable tool for application at industrial level. This will not only make it possible to carry out the chitosan hydrolysis process at high temperature, but also to use large concentrations of substrate without the viscosity becoming excessive. At the level of fundamental research, Csn1794 can provide us with more information on the one hand, on the thermostability of enzymes and on the other hand, on the enzymes of the GH8 family, in particular chitosanases. (Abstract shortened by UMI.)