Fertil kadinlar ve implantasyon basarisizligi olan infertil kadinlarda endometriumun ince yapi ve immünohistokimyasal degerlendirilmesi/Fine structure and immunohistochemical evaluation of endometrium in fertile and infertile women with implantation failure

Headnote

ÖZET

Amaç: Endometrial reseptivite; endometrium epitelinin fonksiyonel basarisi olan geçici bir süreçtir. Bu çalismada, fertil ve Tekrarlayan implantasyon basarisizligi (TIB) olan bireylerin endometrium dokulari, Transmisyon Elektron Mikroskobuyla (TEM) ve E-cadherinle immünohistokimyasal açidan degerlendirilmistir. Amacimiz, sadece fertil ve TIB olan kadinlarin endometrium dokularinin karsilastirilmasini yapmak degil ayni zamanda endometriumda implantasyon sürecinin hücresel çatisi ve mekaniginin daha iyi anlasilmasini saglamaktir.

Gereç ve yöntem: Arastirmamiz için In vitro fertilizasyon (IVF)/ Embriyo Transferi (ET) sonrasi gebelik olusmayan onyedi infertil ve on fertil kadin çalismamiza dahil edilmistir. Rutin isik mikroskobu ve TEM teknikleriyle doku takibi saglanmistir.

Bulgular: Fertil grubun endometrium yüzey epitelinde implantasyon belirteci pinopod olusumuna yogun olarak rastlanirken, infertil grupta yetersiz pinopod olusumu ve belirgin silya ve mikrovillus varligi dikkat çekmektedir. E-cadherin'le yapilan immünohistokimya çalismasinda skorlanma yapilmistir. Fertil grup epitelinde immünreaktivite çok belirsizken, infertil grupta daha belirgin bir boyanma oldugu gözlenmistir.

Sonuç: Son bulgular E-cadherin'in reseptif dönemdeki endometrial epitele yapistirici özellikler aktariyor olmasi yanisira, ikili fonksiyona sahip olmasi üzerinedir. Ilk asamalarda, hücre yüzeyinde yapiskanlik sagladigi, daha sonra epitel hücrelerde ayrilma yaptigi ve blastosistin invazyonunu etkinlestirmek için suprese oldugu düsünülmektedir. Bu çalismada TIB grubunun aksine, fertil grup epitelinin, çok zayif boyanmasi, blastosist implantasyonunu kolaylastirmasi açisindan önemlidir.

Anahtar kelimeler: E-cadherin, endometrium, immünohistokimya, implantasyon

ABSTRACT

Objectives: Being a temporary process, endometrial receptivity is the functional success of endometrial process. In this study, the fertile and recurrent implantation failure (RIF) of individuals with endometrial tissues is analyzed by Transmission Electron Microscopy (TEM) and immunohistochemistry using the E-cadherin. Our goal is not only to make a comparison of endometrial tissues in women with RIF and fertile but also to provide a better understanding of the process and mechanics of the cellular roof during the implantation of endometrium.

Materials and methods: Our research consists of seventeen infertile women who are after In-Vitro fertilization (IVF) / embryo transfer (ET) not occur on pregnancy and ten fertile women were included. Tissue follow-up were performed using routine light microscopy and TEM techniques.

Results: In fertile group, markers of endometrial implantation in the surface epithelium, which are pinopodes were found in heavily. In infertile group, there was prominent cilia formation, microvillus and the presence of inadequate pinopod. E-cadherin using immunohistochemistry study was scoring. When immune-reactivity was very pale in the epithelium of the fertile group, infertile groups showed a clear staining.

Conclusion: Recent findings; E-cadherin transmits adhesive properties to receptive period of endometrial epithelium as well as, having dual functions. Firstly, the cell surface adhesion is provided, then the separation of epithelial cells and is thought to be suppressed to enable the invasion of the blastocyst. Unlike TIB group, weak staining of epithelium of the fertile group, is important to facilitate implantation of the blastocyst.

Key words: E-cadherin, endometrium, immunohistochemistry, implantation.

GIRIS

Implantasyon, insan endometrium dokusuna özel bir süreçtir. Endometrium 'implantasyon penceresi' olarak adlandirilan zaman dilimi içinde embriyoyu kabul eder.1 Implantasyon, döllenmeyi takiben embriyonun endometriuma gelmesi ve burada zonasindan siyrilmasi sonrasinda gerçeklesir. Insanda embriyo yaklasik ovulasyon sonrasi +6 günde, blastosist haline geldikten sonra implantasyon sürecine girer. Diger canli türlerinden farkli olarak, IVF siklüslerinden elde edilen sonuçlara göre insan embriyosu 6-8 hücre iken implantasyon yetenegi kazanabilmektedir. Implantasyon gerçeklesmeden önce endokrin, otokrin ve parakrin mesajlarla, endometrium ve embriyo implantasyon için hazirlanir ve uygun ortam saglanir.2

Endometriumda çesitli yapisal, hücresel ve moleküler olaylar dizisi implantasyon penceresi ile kontrol edilir ve bu durumun sonucunda endometrial reseptiviteyi saglayan gerekli elemanlar ortaya çikabilir.3 Blastosistler, endometrial epitel ile sadece implantasyonun pencere döneminde etkilesime girebilirler.1 Bunu belirleyen ise, korpus luteumdan salgilanan progesteronun, endometriumdaki etkileri ve bunlari takip eden gebeligin 4. günündeki küçük bir östrojen pikidir.3-4 Implantasyon penceresi sirasinda, endometrium epitel hücrelerinin plazma zari bir dizi degisiklige ugrar.5 Birçok memeli türünde, epitel hücrelerinin apikal yüzeyinde genis yuvarlak, projeksiyon görünümünde yapilar mevcuttur.6-7 Endometriumun reseptif faza ulasmasi için ve gebeligin olusmasinda progesteron esastir.8 Reseptivite fazinda; embriyonun yaklasmasi, tutunmasi ve penetrasyonuna izin veren endometriyumda ayni zamanda desidualizasyona giden stromal degisiklikler meydana gelir.9 Implantasyon yetersizligi, IVF'un basarisini sinirlayan önemli faktörlerden biridir. Bir blastosist, implantasyonun baslangici için reseptivite kazanmis bir endometriumla etkilesime ihtiyaç duyar.10 IVF'un basarisi bunlarin uyumlu gelisimine baglidir. Tekrarlayan Implantasyon Basarisizliginin altinda, embriyo ve endometrium baglantili problemler oldugu ileri sürülmektedir.11

Basarili implantasyonun ön kosulu olarak, reseptif endometriumun hazirlanmasi ve blastosistin implantasyonunda önemli rol oynayan molekül etkilesimler, karmasik bir kaskad içerir.8 Bu konuda belirlenen moleküller; sitokinler, büyüme faktörleri, matriks metalloproteinazlari (MMP), adezyon molekülleri, ekstrasellüler matriks komponentleri ve homeoboks element içeren genlerdir.12 E-cadherin, agirlikli olarak epitel dokulardan eksprese olan kalsiyum bagimli hücre adezyon molekülüdür. Doku mimarisinin kontrolü ve bütünlügünün korunmasi ile hücrelerin büyüme ve gelisiminde önemli bir rol oynar.

GEREÇ VE YÖNTEM

Çalismamiza, 17 TIB olan ve 10 fertil kadin dahil edilmistir. Vaka grubu olarak, Istanbul Memorial Hastanesi Yardimci Üreme Teknikleri ve Genetik Tani Merkezi'ne infertilite nedeniyle basvuran ve TIB endikasyonu konan toplam 17 ve 10 kontrol bireyin endometriumlarindan alinan biyopsi örnekleri toplandi. Biyopsi örneklemesi yapilmadan önce bireyler detayli sekilde bilgilendirildi ve onamlari alindi. Bu çalisma Istanbul Memorial Hastanesi Etik Kurulu tarafindan onay alinarak yapildi. Endometrial doku örneklerine TEM ve immünohistokimyasal analiz yapilmak amaciyla rutin doku takibi uygulanmistir.

Elektron mikroskop doku takibi

Elektron mikroskobik inceleme için alinan dokular, öncelikle, kan, mukus, akinti sivisindan temizlenmek üzere, hassasiyetle 100IU/ml penisilin, 0.1mg/ ml streptomisin ve 0.25µg/ml amfoterisin içeren Early's Balanced Salt Solution (EBSS) ile birkaç kez yikandi. Tesbit edilmek üzere, 1 mm3'lük parçalara bölündü ve 1. tesbit solüsyonumuz olan % 2.5'luk hazirlanan gluteraldehitte, yaklasik 4-6 saat tesbit edilen dokular, tampon solüsyonu içine alinarak yikandi (3x10 dak.) sonrasinda yeni tampona alindi. Ertesi gün tamponu uzaklastirilan dokular, ikinci tesbit solüsyonu içine kondu. (%1'lik osmium tetroksit, 1,5 saat). Tesbit isleminin ardindan PH'yi nötralize ederek doku hasarini en aza indirgemek için, dokular tamponda bekletildi. Dehidratasyon için, artan oranlarda etil alkole konuldu (% 30, % 50, % 70, % 90, %100, %100 etil alkol X10dak.). Geçis sivisi olarak propilen oksit kullanildi (2X15 dak. rotatorda). Propilen oksit ve gömme materyalinin asamali olarak dokulara infiltrasyonunu saglamak üzere, propilen oksit ve rezin karisimlari uygulandi. Gömme Materyali için Araldite (CY212 R1030) kullanildi. Ertesi gün dokular polietilen kapsüllere gömüldü ve 60 °C etüvde 36 saat birakilarak, polimerizasyonu saglandi. Doku bloklarindan, ultramikrotom (Leica Ultracut) ile cam biçak kullanilarak ortalama 70 nm kalinlikta kesitler elde edildi ve bakir gridlere alindi. Kesitler, kontrastlandiktan sonra incelenmek üzere transmisyon elektron mikroskobu (Jeol 1011) ile degerlendirildi.

Immünohistokimya doku takibi

Dokularin immünohistokimyasal açidan degerlendirilmesinde E-cadherin kullanildi. Lamlara alinan doku kesitleri, 55°C'de bir gece, 65°C'de bir saat bekletildi, deparafinizasyon ve dehidratasyon islemleri uygulandi, sonraki asamalarda distile suda ve fosfat tuz tamponunda (PBS, pH: 7.2-7.4) yikanmasi saglandi. Antijenik maskelenmenin olusmamasi için doku kesitleri, sodyum sitrat tamponu (0.01M, pH: 6.0, 978 ml dH2O için de 2.94 gr trisodyum sitrat ve 22 ml HCl) içinde mikrodalga firinda islem gördü (2X3 dak. ). Sonra PBS'den geçirilerek hidrojen peroksid (Biogenex HK 111-5K, %3) uygulandi. PBS'de yikanan kesitler primer antikorlariyla bir gece inkübe edildi (oda isisi ve nemli ortam). PBS'den geçirilen kesitlere sirasiyla 30'ar dakika biyotinli sekonder antikor human E-cadherin (Zymed, San Francisco, CA) ve streptavidin-peroksidaz kompleksi uygulandi. Tekrar PBS'den geçirilen kesitler, 3,3' diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB-Kit, 00-2020, Zymed) ile 2-5 dakika islem gördü. Distile suyla yikanan kesitlerin takipleri yapildi. Kesitler alinarak isik mikroskobik inceleme yapildi (Nikon Eclipse 80i).

Istatistiksel Analiz Kesitler, Nikon Eclipse 80i isik mikroskobunda incelendi. Immünreaktivite yogunlugu 0.5 (Çok zayif ), 1 (Zayif), 2 (Orta dereceli), 3 (Güçlü) gruplarinda yari kantitatif olarak ayni arastirmaci tarafindan degerlendirildi. Immünreaktif hücre yüzdesi ortalama 100-300 hücre sayilarak elde edildi. Immünreaktif hücre yok ise skor 0, %10 pozitif hücre skor 1, %10-50 skor 2, %51-80 skor 3, %80 ve üzeri skor 4 olarak degerlendirildi. Immüno Histokimyasal Skor (IHS); literatüre göre immünreaktif hücre sayi skoru ile yari kantitatif immünoreaktivite yogunlugu degerlerinin çarpimi sonucunda elde edildi.13-14

BULGULAR

Fertil ve TIB grubu endometrium dokusunun elektron mikroskobik degerlendirilmesi

Fertil grubun endometrium yüzey epitel hücreleri incelendiginde; salgi vakuolleri ve salgi içerigiyle dolu pinopod adi verilen sitoplazmik uzantilar gözlendi. Lümen içinde salgi materyali olarak, hücrelerle baglantisini yitirmis sitoplazmik uzanti (pinopod) parçalari bulunmaktaydi. Salgi vakuollerinin daha yogun olarak hücrelerin supranuklear bölgelerinde yer aldigi gözlendi (Sekil 1a).

Tekrarlayan implantasyon basarisizligi grubu endometrial doku örneklerinde ise; Endometriumun yüzey epitelinin alçak silindirik hücrelerden olustugu gözlendi. Çogu hücrelerin apikalinde çok sayida düzensiz mikrovilluslar vardi, bu hücrelerin arasinda daha seyrek olarak silyuma sahip hücrelere rastlandi. Lümene yakin alanlarda salgi vakuolleri de bulunmasina ragmen saglikli pinopod yapisi olusturamadiklari gözlendi. Lümene dogru az miktarda pinopod benzeri yapi bulunuyordu. Yüzey epitel hücrelerinin sitoplazmasinda gelisigüzel dagilmis salgi vakuolleri vardi (Sekil 1b).

Fertil ve TIB grubu endometrium dokusunun immünohistokimyasal degerlendirilmesi

Bu gruplarin isik mikroskobik olarak degerlendirilmesinde fertil grubun endometrium epitel hücrelerinde immünohistokimyasal açidan E-cadherin'in immünreaktivitesi degerlendirilmistir (Tablo 1). Fertil grup endometrium dokusu yüzey epitelinde, E-cadherin ile IHS skorlamasina göre yok veya çok zayif boyanma olmasina ragmen (Sekil 2a), bez epitelinin daha belirgin olarak ve IHS skorlamasina göre orta boyanma gösterdigi gözlenmistir (Sekil 3a). TIB grubunun E-cadherin immünreaktivitesi açisindan degerlendirilmesinde; endometrium yüzey epitelinde orta düzeyde boyanma gösterdigi (Sekil 2b), bez epitelinde ise boyanmanin zayif oldugu belirlenmistir (Sekil 3b).

Istatiksel Analiz

Istatistiksel analizler SPSS 11.5 paket programinda yapilmistir. Verilerin normal dagilim göstermesi nedeniyle Independent-Samples T testi yapilmistir. Fertil ve TIB grubu endometrial yüzey epitelleri Ecadherin için karsilastirildiginda istatistiksel farklilik bulunmustur (p<0,001). Fertil ve TIB grubu bez epitelleri de E-cadherin için karsilastirildiginda p=0,009 olarak bulunmus olup, istatistiksel açidan anlamli oldugu tesbit edilmistir.

TARTISMA

Bugüne kadar yapilan çalismalar sonucunda implantasyon ve gebelik oranlarini etkileyen baslica faktörler arasinda oosit, embriyo kalitesi ve endometrium yer almaktadir.15 Üremeye Yardimci Tekniklerle ilgilenen uzmanlarin IVF basarisizliklarinda altta yatan nedeni, kötü embriyo kalitesine baglama egilimleri oldukça fazladir. Oysa embriyolojik faktörler yaninda, implantasyon problemine yol açan kötü endometrial reseptivite gibi birçok faktör IVF basarisini etkileyebilir.16-17 Yetersiz endometrial reseptivite, implantasyon basarisizliginin yaklasik üçte ikisinden sorumludur.18 IVF'da tekrarlayan implantasyon basarisizligi kompleks bir konudur ve henüz tamamen anlasilamamistir.19

Implantasyon; blastosist ve endometrial tabakalar arasinda kendiliginden gelisen dinamik bir süreç olmasina ragmen, implantasyon penceresi boyunca endometriumun hazirlanmasi tamamen maternal kaynaklidir. Aksine saglikli kadin infertilitesinin en büyük sebebi, üreme tibbinda henüz çözümlenememis olan implantasyon basarisizligidir. TIB'nin tanimi; ardisik üç IVF/ICSI-ET siklusunda veya toplam 10 adet iyi kalitede embriyonun transferini takiben gebelik olusmamasi olarak kabul edilmektedir.20 Reseptif periyotta, hormonlarla kontrol edilen endometrial epitel hücrelerinde, moleküler anlamda da bazi degisiklikler olusur ve hücre yüzey degisiklikleriyle birlikte, glikokaliksin kalinliginda azalma meydana gelir.21-,23 Apiko-bazal polarite kaybi olmaksizin es zamanli olarak epitel hücre adezyon moleküllerinde kayip olusur. Ancak apikal hücre-hücre etkilesimi ve endometrium epiteliyle trofoblast arasinda bir yakinlasma meydana gelir.24-25 Implantasyonla ilgili olarak, bizim de kullandigimiz E-cadherin, en çok çalisilan bir alt sinifitemsil eder. Epitel plazma membranlarinin lateralindeki ara baglantilar (adherens junction) denilen özel bölgelerde lokalize oldugu bilinmektedir. E-cadherin ekspresyonunun bastirilmasi, temel moleküler olaylarda hücre-hücre adezyonunun engellenmesine neden olabilir. Fare embriyo implantasyonunda yapilan çalismalar göstermistir ki, E-cadherin genlerinde olusturulan mutasyonlar, preimplantasyon sürecinde defektler olusturmaktadir.26 Insan embriyosunun implantasyonunda E-cadherin'in rolü bilinmiyor, ancak bu süreç için E-cadherin ekspresyonunun önemi bilinmektedir. Luteal faz boyunca E-cadherin mRNA seviyelerinde artis gözlenmektedir. 27 Dawood, Poncolet ve arkadaslari tarafindan, bu menstrual siklus degisikliklerinin, immünohistokimyasal çalismalarla protein seviyesinde tesbit edilmedigi belirtilmektedir.28-29 Bizim çalismamizda fertil ve TIB olan kadinlarin endometrium dokularinin, E-cadherin'in ekspresyonu açisindan degerlendirilmesi saglanmistir. E-cadherin'in regülasyonu, hücreler arasi kalsiyum tarafindan yapilir. Kalsiyumdaki artis, ara baglantilardaki E-cadherin'in dagilimina ve hücre iskeletinin yeniden organize olmasini saglayan, anahtar sinyal yolaklarinin aktive olmasina yol açar. Hücreler arasi kalsiyum konsantrasyonundaki degisiklikler, hücre adezyon moleküllerinin yeniden yapilanmasini tetikler ve bu durumdan epitel hücrelerinin yapisiklik ve polaritesi etkilenmektedir.30 Bu çalismada da fertil ve TIB grubu bireylerin endometrium dokularinin E-cadherin açisindan farkli sonuçlar vermesi bu durumu dogrulamaktadir. Li ve arkadaslarinin kültüre edilmis Ishikawa hücreleriyle yaptigi çalismada, hücreler arasi kalsiyum artisi, kalsitonini tetikleyerek, E-cadherin ekspresyonunun hücresel baglanti bölgelerinde suprese edildigini ortaya koymuslardir.31 Sekretuar faz boyunca insan endometrial epitelinde artan progesteron nedeniyle kalsitonin seviyesinin artmasi dikkat çekicidir.32 Bizim çalismamizda da, sekretuar fazda alinan fertil grup endometrial dokularinin yüzey epitelinde E-cadherin'le boyanma yok veya çok zayif seklinde tesbit edilmistir (Sekil 2a). Oysa TIB grubunda E-cadherinle homojen olarak daha belirgin bir immünreaktivite gözlenmistir (Sekil 2b). Fertil grubun bez epitelinin boyanmasini TIB grubuyla karsilastiracak olursak, Fertil grupta belirgin boyanma gözlenmis olup, istatiksel olarak anlamli bir fark tesbit edilmistir (Sekil 2b,3b).

Özellikle insan endometrial epiteli progesteron tarafindan indüklenir. Progesteron belki de, endometrial kalsitonon indüksiyonu yoluyla hücreler arasi kalsiyumu artirabilir ve E-cadherin ekspresyonunu regüle edebilir.33 Bu durumda E-cadherin'in ikili fonksiyona sahip olmasi ihtimali mümkündür. Ilk asamalarda, hücre yüzeyinde eksprese olmasi yapiskanlik saglamak için gereklidir. Buna karsilik, daha sonra E-cadherin'in epitel hücrelerde ayrilma yaptigi ve blastosistin invazyonunu etkinlestirmek için suprese oldugu düsünülmektedir. Çalismamizda fertil grup yüzey epitelinin E-cadherin için yok veya çok zayif boyanmasi, burada bahsedilen düsünceyle de dogrulanmaktadir.

E-cadherin, hücre-hücre arasi etkilesimde önemli olan, Ca bagimli, transmembran glikoprotein ailesidir. Bu ailenin üyeleri çesitli dokularda farkli olarak eksprese olurlar. Tip 1 ve tip 2 seklinde subgruplari olan cadherinler endometrial epitelde doku bütünlügü ve morfogenezi saglayan önemli bir moleküldür. Basarili implantasyon, yasam için kritik oldugundan dolayi, endometrial reseptivite için büyük olasilikla birden fazla ve dinamik mekanizmalar var olabilir. Ayrica bu fonksiyonda bulunan, bazi kritik genlerin yer aldigi düsünülmektedir. Implantasyondaki moleküller ve eylem mekanizmalarinin tanimlanmasi, implantasyon sürecinin daha iyi anlasilmasini saglayacaktir. Son bulgular E-cadherin'in reseptif dönemdeki endometrial epitele yapistirici özellikler aktariyor oldugu üzerinedir. E-cadherin ekspresyonunun, AN3-CA hücrelerinde epigenetik olarak düzenlenmesi endometrial reseptiviteyi kontrol eden bir mekanizmadir.34-35 Bu epigenetik düzenleme mekanizmasi, dogum kontrolünü gelistirme ya da yardimci üreme tekniklerinde basari oraninin artirilmasi için yeni terapötik hedeflerin belirlenmesinde kritik bir ilk adim olabilir. Ecadherin'in insan endometrial reseptivitesinin gelismesinde anahtar rol oynadigi ve biyolojik olaylarda önemli bir faktör oldugu düsünülmektedir. Ancak, bunun aydinlatilmasi için daha ileri çalismalara ihtiyaç vardir.

References

KAYNAKLAR

1. Susan JK. Molecular interactions at the maternal-embryonic interface during the early phase of implantation. Sem Reprod Med 2000;18(3):237-43.

2. Attar E. Spermatogenezis, Fertilizasyon, Erken embriyo gelisimi ve Implantasyon. Umur Çolgar. Reproduktif Endokrinoloji ve Infertilite, 1. baski. Istanbul: Istanbul Medikal Yayincilik, 2006:34-45.

3. Paria BC, Lim H, Wang XN, Liehr J, Das SK, Dey SK. Coordination of different effects of primary estrogen and catecholestrogen on two distinct targets mediates embryo implantation in the mouse. Endocrinology 1998;139(12):5235-46.

4. Sunder S, Lenton E. Endocrinology of the Peri Implantation Period. Clin Obstet Gynaecol 2000;14(5):789-800.

5. Murphy CR, Shaw TJ. Plasma membrane transformation: a common response of uterine epithelial cells during the periimplantation period. Cell Biol Int 1994;18(12):1115-28.

6. Murphy CR. Junctional barrier complexes undergo major alterations during the plasma membrane transformation of uterine epithelial cells. Hum Reprod 2000;15(3):182-8.

7. Salmani MK, Nikzad H, Shiokawa S, Akimoto Y, Iwashita M. Secretory role for human uterodomes (pinopods): secretion of LIF. Mol Hum Reprod 2005;11(8):553-9.

8. Rashid NA, Lalitkumar S, Lalitkumar PG, Gemzell-Danielsson K. Endometrial Receptivity and Human Embryo Implantation. Am J Reprod Immunol 2011;66(1):23-30.

9. Defrere S, Langendonck A, Moulin P, et al. Human endometrial epithelial cells (EEC) contitutively express more intercellular adhezion molecule (ICAM)-1 than endometrial stromal cells (ESC) in culture. Am J Reprod Immunol 2005;54(1):5-12.

10. Nikas G, Develioglu OH, Toner JP, Jones HW. Endometrial pinopodes indicate a shiftin the window of receptivity in IVF cycles. Hum Reprod 1999;14(3):787-92.

11. Tan BK, Vandekerckhove P, Kennedy R, Keay SD. Investigation and current management of recurrent IVF treatment failure in the UK. BJOG 2005;112(6):773-80.

12. Dey SK, Das SK, Reese J, Paria BC, Daikoku T, Wang H. Molecular cues to implantation. Endocr Rev 2004;25(3):341-73.

13. Lee CN, Chang SW, Cho NH, Cho SH. Nitrous oxide synthase expression in placenta of preeclampsia. J Korean Med Sci 1997;12(6):532-8.

14. Mutlu C, Koyutürk M, Karpuz V. Evaluation of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) immunreactivity of fetal and maternal placenta. Cerrahpasa J Med 2005;36(1):109-15.

15. Iltemur DC, Satiroglu H, Berker B, Çetinkaya H, Kahraman K. Yardimla üreme tekniklerinde implantasyon ve gebelik oranlarini etkileyen faktörler. T Klin J Gynel Obst 2003;13(4):466-75.

16. Akar M, Kursun S, Taskin Ö. Tekrarlayan In vitro Fertilizasyon Basarisizliklarinda Yaklasim. Türk Fertil Der 2004;12(3):217-24.

17. Bahar L, Baykal T. Implantasyon Sürecinde Endometriyum. Mersin Üniversitesi Saglik Bilimleri Dergisi 2008;1(2):1-7.

18. Ledee-Bataille N, Lapree-Delage G, Taupin JL. Concentration of leukaemia inhibitory factor (LIF) in uterine flushing fluid is highly predictive of embryo implantation. Hum Reprod 2002;17(1):213-8.

19. Bee K, Tan BK, Vandekerckhove P, Kennedy R, Keay SD. Investigation and current management of recurrent IVF treatment failure in the UK. Int J O & G 2005;112(6):773-80.

20. El-Toukhy T. and Taranissi M. Towards better quality research in recurrent implantation failure: standardizing its definition is the first step. Reprod Biomed Online 2006;12(3):383-5.

21. Elder K, Dale B. Preimplantation Genetic Diagnosis. In Vitro Fertilization, 2nd edn. Cambridge: Cambridge University Press, 2000:1-33.

22. Bahar L, Kahraman S, Baykal T. Comparatively Evaluation of Infertile (RIF) and Fertile Women Endometrial Biopsies at the Ultrastructural Level by TEM. In: Dubuisson JB, Gomel V. Reproductive Medicine and Surgery from the Proceedings of the 15th World Congress on In Vitro Fertilization and 4th World Congress on In Vitro Maturation, 1st edn. Geneva, Monduzzi International Proceedings, 2009:171-3.

23. Nikas G. Pinopodes as markers of endometrial receptivity in clinical practice. Hum Reprod 1999;14(2):99-106.

24. Tinel H, Denker HW, Thie M. Calcium influx in human uterine epithelial RL95-2 cells triggers adhesiveness for trophoblast-like cells. Model studies on signalling events during embryo implantation. Mol Hum Reprod 2000;6(12):1119-30.

25. Thie M, Harrach-Ruprecht B, Sauer H, Fuchs P, Albers A, Denker HW. Cell adhesion to the apical pole of epithelium: a function of cell polarity. Eur J Cell Biol 1995;66(2):180-91.

26. Bloorl DJ, Metcalfe AD, Rutherford A. Brison DR. Kimber SJ. Expression of cell adhesion molecules during human preimplantation embryo development. Mol Hum Reprod 2002;8(3): 237-45.

27. Fujimoto J, Ichigo S, Hori M, Tamaya T. Alteration of Ecadherin, alpha and beta-catenin mRNA expression in human uterine endometrium during the menstrual cycle. Gynecol Endocrinol 1996;10(1):187-91.

28. Dawood MY, Lau M, Khan-Dawood FS. E-cadherin and its Messenger ribonucleic acid in periimplantation phase human endometrium in normal and clomiphene-treated cycles. Am J Obstet Gynecol 1998;178(5):996-1001.

29. Poncelet C, Leblanc M, Walker-Combrouze F, et al. Expression of cadherins and CD44 isoforms in human endometrium and peritoneal endometriosis. Acta Obstet Gynecol Scand 2002;81(3):195-203.

30. Gumbiner B, Stevenson B, Grimaldi A. The role of the cell adhesion molecule uvomorulin in the formation and maintenance of the epithelial junctional complex. J Cell Biol 1988;107(4):1575-87.

31. Li Q, Wang J, Armant DR, Bagchi MK, Bagchi IC. Calcitonin down-regulates E-cadherin expression in rodent uterine epithelium during implantation. J Biol Chem 2002;277(4):447-55.

32. Kumar S, Zhu LJ, Polihronis M, et al. Progesterone induces calcitonin gene expression in human endometrium within the putative window of implantation. J Clin Endocrinol Metab 1998;83(12):4443-50.

33. Zhu LJ, Bove KC, Polihronis M. Calcitonin is a progesterone regulated marker which forecasts the receptive state of endometrium during implantation. Endocr J 1998;139(9):3923-34.

34. Rahnama F, Thompson B, Steiner M, et al. Epigenetic regulation of e-cadherin controls endometrial receptivity. Endocrinology 2009;150(3)1466-72.

35. Shih HC, Shiozawa T, Miyamoto T, et al. Immunohistochemical expression of e-cadherin and catenin in the normal and malignant human endometrium: An inverse correlation between e-cadherin and nuclear catenin expression. Anticancer Res 2004;24(8):3843-50.